小 🐼 鼠神经干细胞原 🦢 代提取（小鼠神经干细胞的分离及培养实验）
- 作者: 张清然
- 来源: 投稿
- 2025-09-25
1、小鼠神经干细胞原代 🌲 提取 🐕
小鼠神经干细 🦊 胞原代提取
材料胚 🐎 胎小 🐡 鼠（E12.5E14.5）
冷 🦄 冻液（Hank's 平衡 🦄 盐溶液、10% DMSO、10% FBS）
去离子 🌾 水 🐳
70% 乙 🐈 醇 🌼
无菌手术器械手术（剪刀手术 🌴 、镊子）
神经干细胞 🌿 培养基（DMEM/F12、B27 补充剂 🐝 、EGF、FGF2）
步骤1. 胚胎获 🕷 取：处死怀孕小鼠，解，剖子宫取出胎儿 🐈 收集 E12.5E14.5 的胚胎。
2. 无菌处理：将胚胎浸泡在 70% 乙 🐱 醇中 1 分钟 💮 ，然后用无菌去 🦢 离子水冲洗三次。
3. 组织解剖：在无菌操作条件下，使，用手术剪刀和镊子切除胚胎头颅 🐒 移除脑组织。
4. 神经干细胞分离：将脑组织放入含 100 U/mL papain 和 25 mg/mL DNase I 的神经干细 🐦 胞培养基中，37°C 孵育分 45 钟。
5. 机械解离：用钝头 🦉 移液管吹打脑组织，使组织解离成单细胞。
6. 过滤：将细胞悬浮液通过细胞滤 40 μm 网过滤，去除残 🌹 留组织碎片。
7. 离 🦉 心 🦈 ：将 🍀 过滤后的细胞悬浮液以离心 1000 rpm 分 5 钟。
8. 细胞重悬：用神经干 🌸 细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密 🦄 度为 510 x 10^5 个细胞/mL。
9. 培养：将细胞接种到涂有 polyLornithine 和层粘连蛋白的培 🐋 养皿中，37°C、5% CO2 条件下培养 🦍 。
注意事项无菌操作至关重 💐 要，以防止培养物 🦅 污染。
优 🐋 化酶消化时间以最大程度地分离神经干细胞，同时最大程度地减少细胞损 🌾 伤 ☘ 。
定期更换培养 🦊 基以维持无菌条件并 🦍 为细胞提供营养。
使用生长因子（如 🌸 EGF 和 FGF2）刺激神 🕸 经干细胞的分化。
2、小鼠神经干细胞 🦅 的 🐝 分离及培养实验
小 🐞 鼠 💐 神经干细胞的分离及培养 🌵 实验
材 🦅 料和试 🦈 剂
实验 🌼 动物：C57BL/6小 🐦 鼠 🌴 ，68周龄
培养基培养基 🐳 ：Neurobasal
生长 🦈 因子：EGF、bFGF
培养板：聚 🐶 赖氨 🦈 酸涂 🕷 层的6孔板孔板、12或孔板96
分离液 🐺 ：HBSS溶液（含EDTA和海马蛋白 🦟 酶 🦍 ）
血清 🐈 ：小牛血清（NBS）
抗生素：青霉素/链霉 🌺 素
其他：解剖工 🐺 具、离、心机显微镜
实验步骤一 🦢 、小鼠脑组 🦅 织分离
1. 处 🌵 死小鼠并取出大 🕷 脑 🐼 。
2. 移除大脑膜和 🦅 脑小 🌸 脑。
3. 将分离的脑 🐶 组织置于HBSS溶液中 🌷 。
二、分 🕷 离神经 🌲 干 🌾 细胞
1. 将脑组 🐅 织 🌷 切成小块 ☘ 。
2. 用离心 🪴 机离心脑 🐘 组织块，收集上清液。
3. 加入生 🕸 长因子EGF和 🍁 bFGF至上清液中 🐡 。
三 🐒 、培养神经干细胞
1. 将上清液 🌳 加 🕷 入涂有聚赖氨酸的培养板中。
2. 加入血清 🐺 和抗生素。
3. 在37°C、5% CO2培 🐵 养箱中培 🌴 养。
四 🐝 、换液 🕸 和 🍀 传代
1. 每 🌳 23天更换一次培养 🦄 基 💮 。
2. 当细胞生长至6080%汇合时传代 🪴 。
3. 去除培养基，用PBS冲洗细 🐈 胞 🦟 。
4. 加 🦋 入 🕸 胰蛋白酶，消化细胞。
5. 离心收集细胞，并 🌸 重新接种至 🦆 新的培养板中。
细胞表征形态观察：神经干细胞 🦍 通常呈多极性 🦍 、星形形 🐕 态。
免疫细 🐋 胞化学：可以使用Nestin、GFAP等神经干细胞标记 🐶 物进行免疫细胞化学染色。
注意事项使用无 🐒 菌技术进行 🕊 所 🦢 有操作。
使用新鲜的小鼠脑组 🌳 织。
培养基 🐝 应新鲜配 🐧 制。
避免 🐅 过 🐧 度消化细胞。
定 🌳 期监测细胞生长情况 🍀 。
3、小鼠 🐛 神经干细胞原代 🐈 提取技术
小鼠神经 🌻 干细胞 🐶 原代提取技术
材料小 🐎 鼠 🐧 （P0P5）
冷 🐯 PBS
胰 🌴 蛋 🦍 白酶 🕊 （0.25%）
DNase I
神经基 🕷 质培 🐼 养基
组织 🐦 培养皿/板
无血清神经 🌵 基质培养基
步骤1. 准备 🐯 小鼠
人道处死 🐼 小 🐕 鼠，收集大脑。
在冷 PBS 中 🌷 浸泡大脑 🦋 5 分钟。
2. 去除脑 🐠 膜
用镊子小心地从大 🦆 脑表面剥离脑膜。
3. 切碎 🌲 大 🌷 脑
将大脑 🍀 转移到组织培养皿中，使用手术刀或玻璃移液管 🌴 切碎成小块。
4. 消 🐱 化 🌵
加入含胰蛋 🐳 白酶和 DNase I 的冷 PBS（每克脑组 🐘 织 23 ml）。
在 37°C 的 🐦 振荡器中孵育 1530 分钟 🐺 ，直至组织 🌹 碎块解离。
5. 终止消 🦁 化
加入等体积的无血清神经基质培养基，终止消化 🦆 。
6. 离心 🐺
将细胞悬浮液 🐶 在 300 x g 下离心 10 分钟。
去除上清液，小心地重悬细胞于新 🦆 鲜 🌼 的神经基质培养基中。
7. 过滤 🌺
通过 🐬 70 μm 细胞 🕸 筛过滤细胞悬浮液，去除未解 🐘 离的组织碎块。
8. 计数 🐼 和接 🌷 种
计数细胞，并将细胞接种到聚 🌻 赖氨酸包被的组织培养皿/板中。
培养于 🐎 37°C、5% CO2 的 🌻 培养 🐼 箱中。
提示使用新鲜、年轻的小鼠样品以 🐝 确保最佳的细胞质量。
在 🐦 整个过程中保持无菌 🐼 条 🐧 件。
如果消化时间过长，可 🐼 能会损 🍀 坏细胞。
优化胰蛋白酶和 🌼 DNase I 的浓度 🌷 以获得最佳 🌿 的细胞分离。
培养基 🐱 的成分可能会根据具 🦟 体 🐴 的研究目的而有所不同。
4、小鼠神经元原代细胞 🦢 培 🐎 养
小鼠神经元原 🐺 代细胞培养
材料小鼠脑
Hank's 缓 🍁 冲液 (HBSS，无钙无镁)
胰蛋 🐘 白酶溶液胰蛋白 🐝 酶 (0.25% ，2 mM EDTA，HBSS)
神 🌲 经元生长培养基 (NBG)
多聚L赖氨 🍀 酸 (PLL)
培养皿或培养板 🕊
移液枪细胞计 🪴 数器
显微镜步骤
1. 组 🐅 织解剖
在无菌条件下，解剖 17 天大 🐴 的小鼠 🦆 脑。
去除脑膜并切取海马体或感兴趣 🐱 的 🌴 区域。
2. 酶 🦍 消化
将海马体组织切成小块，放入胰蛋 🌲 白酶溶液中。
置于 37°C 孵育 1530 分钟 🦁 ，每分钟 5 吹打一 🌷 次细胞。
离 🌷 心 5 分 🐡 钟 🦟 ，4°C，1000 g。
3. 细胞 🕷 悬浮 🐅
去除 🕷 上清液 🌿 ，用 🌵 NBG 重悬细胞。
用细 ☘ 胞计数器 🐵 计数细胞 🐬 数量。
4. 细 🌺 胞接 🐺 种 🌼
将 🦋 细胞稀释至所需的浓度（通常为 🐟 510 x 10^5 个细胞/ml）。
将 PLL 溶液涂布于培养皿或培养板 🐦 中，以促进细胞粘附。
按所需体积将细胞悬浮液 🐴 接种到 🌾 培 🍀 养皿或培养板中。
5. 培 🦍 养
将 🐶 培 🌾 养物置 🌿 于 37°C，5% CO2 的培养箱中。
每 23 天更 🐱 换培养基。
6. 鉴定和 🐝 分 🌺 析
使用免疫细胞化 🌸 学或荧光 🦁 染色对神经元进行鉴定。
使用显 🐞 微镜观察细胞形态、突触 🐝 形成和生长 🐅 。
进行电生 🐬 理 🕊 实验以评估 🐬 功能。
提示使用 🐅 高质量的酶并 🐼 严格遵循孵 🐈 育时间。
在接种后 24 小时内去除未粘附的 🐅 细胞。
定期检查培 🐝 养物是否存在 🐒 污 🐛 染。
不同 🐶 来源和年龄的小 🐼 鼠神经元原代细胞的培养条件可能有所不同。优。化条件对于获得健康和活跃的神经元培养至关 🪴 重要
