大鼠牙髓干细胞分离（大鼠牙髓干细胞 🌸 分离原理）
- 作者: 胡念一
- 来源: 投稿
- 2025-08-18
1、大鼠牙髓 🦆 干细胞分离
大 🌸 鼠牙髓干 🐅 细胞分离
材料：大鼠 🐈 下颌磨牙或前臼齿 🦊
无菌培养 🌳 基（如 DMEM/F12）
无血 🦆 清培养 🐺 基（如 DMEM/F12）
胶 🌴 原 🐵 酶 🍁 IV
胰 🦢 蛋白酶
胎 🍁 牛 🌲 血清（FBS）
培养板培养瓶
流式 🦁 细胞仪（可选）
步骤：1. 牙齿 🌸 提取和 🐎 消 🐧 毒
处死大鼠，摘除 🕊 下颌磨 🐱 牙或前臼齿。
使用 🦉 无菌生理盐水冲洗牙齿，除去残留 🦉 组织。
将牙齿浸泡于 70% 乙醇中 1 分 🐶 钟消毒。
2. 牙髓 🐳 移除 💮
使用无菌镊 🕊 子或解剖针小心地去除牙齿冠部和 🦆 根部。
用无菌显微剪刀切开剩余 🦁 的牙髓室。
将牙髓小心地刮出 🐼 并转移至无血清培养基中。
3. 酶 🍀 消 🌿 化 🐳
向 🌳 牙髓悬液中加入胶原酶 IV（1 mg/mL）和胰蛋白 🐴 酶 🐛 （1.5 mg/mL）。
37°C 孵 🐎 育 1 小时，轻柔 🌾 地吹打以促进消化 🌲 。
4. 细胞分离 🌸
将细 🐒 胞 🐈 悬 🦟 液离心（400 x g，5 分钟）。
去除上清液并用无血清 🐶 培养基重悬细胞 🐡 。
通过 70 微米细胞 🦄 滤网过滤 🦍 细胞悬液去除碎 🐠 片。
向细胞悬液中加入 🐠 FBS（10%）。
5. 培 🦢 养
将细胞接种到 🐅 培养板或培养瓶中，每孔或瓶中接种 🌺 约 1 x 10^6 个 🐶 细胞。
使用无 🌿 菌培养基培养（DMEM/F12）细 🐘 胞。
6. 克隆形成单位（CFUF）检（测）可 🐈 选
在培养板中接 🌸 种 🌻 单个细 🦍 胞，每孔接种个细胞 50100 。
1014 天后，固定和染 🌼 色细胞。
计数形成 50 个 🐡 或更多细胞的克 🌼 隆，以评估干细胞频率。
7. 流 🐱 式细胞术分析（可选）
从培养物中收集细胞并用抗体标记 🐡 。
使用流式细胞仪分析细胞表型，确定牙髓干细胞标记物（如 STRO1、CD271、CD90）的 🪴 表达。
注意事项 🕷 ：
保持无菌 🌼 操 💮 作环境。
使用 🐬 高浓度的胶原酶 IV 和胰蛋白酶可能会 🌹 损害细 🪴 胞。
牙髓干细胞是异质性的，可能存在 🦟 不同 🦈 亚群。
2、大鼠 🌳 牙 🌷 髓干细胞分离原理
大鼠 🦄 牙髓干细胞分离原理 🍀
大鼠牙髓干细胞 (RDSCs) 是从大鼠牙髓组织中分离 🐕 出来的一种间充质干细胞分离的。基 RDSCs 本原理包括：
1. 牙 🦆 髓组织 🐠 收集：
选择健康的年 🐎 轻大鼠，以获得质量更好 🐱 的牙髓组织。
在无菌条件下，拔除大鼠的 🐦 上 🦄 颌或下颌磨牙 🐺 。
2. 牙 🦋 髓组织消化 🐘 ：
使用含有胶原酶和蛋白酶的酶 🐯 溶液，将 🦁 牙髓组织消化成单 🐦 细胞悬液。
消化时间 🐵 和酶浓度根据不 🐅 同实验条件而定 🐼 。
3. 细胞悬 🌹 液过滤和清 🌴 洗：
将消化后的细胞悬 🕷 液通过细 🐈 胞过滤网，去除组织碎片和其他细胞 🌸 残骸。
用含抗生素的培养基 🐴 反复清洗细胞，去除任何污染物。
4. 细胞增殖和 🕊 贴壁选择：
将分离的细胞 🐕 悬液接种到含生长因子的培养基中，并在 37°C、5% CO2 环境下培养。
干细胞具有贴壁生长的能力，而 🐯 其他细胞通常悬浮 🌸 在培养基中 🌴 。
通过多次传代培养，可 🐦 以富 🐈 集贴壁生 🦊 长的 RDSCs。
5. 细胞表 🐳 型鉴定：
使用流式细胞术或免疫细胞化 🦅 学技术，分析 🐴 RDSCs 的细胞表型。
RDSCs 通常 🐋 表达间充质干细胞标志物，如 CD29、CD44 和 CD90，但，不表达造血干细胞标志物如和 CD34 CD45。
6. 多 🌸 向分化 💮 潜能验证：
通过诱导分化实验验，证 RDSCs 多向分化成骨细 🐵 胞、脂肪细胞和软骨细胞的 🦢 能力。
这种多向分化潜能是干细胞的 🌸 一个关 🐶 键特征。
遵循这些原理，可以从大鼠牙髓组织中成功分离和鉴定这些 RDSCs。细胞在组织再生、免。疫调节和疾 🐼 病治疗方面具有广泛的研究应用
3、大鼠牙髓干 🐦 细胞分离方法
大 🐶 鼠牙髓 🐡 干细胞分离方法 🦅
材料 🕊 和 🐬 试 🐞 剂：
新 🐵 鲜的大鼠牙齿
无菌的器 🐞 械和 🐱 培养皿 🐶
αMEM 培 🌷 养 🌴 基 🐕
胎牛 🐬 血 🦟 清 🕊 (FBS)
青霉素 ☘ /链霉素溶液
胶原 🐦 酶 🕷 I
胰蛋白酶 🐛
密 🌼 度梯 🌴 度液
流式细胞 🌸 仪
步骤：1. 样 🪴 本收集和组织消化
从 🐎 健康大鼠中取出新鲜的牙齿。
用 🌲 无菌生理盐水冲 🌾 洗干净。
使用显微镜检查 🐒 牙齿并分离牙 🐵 髓。
将 🐺 牙髓组织切成小块。
用胶原酶 I 和胰蛋白酶消化组织，并在 37°C 培养 🐯 箱中孵育。
2. 细胞 🍀 分 🦋 离 🐟
将消化 🐞 后的组织悬浮 🦅 液离心以去除细胞碎片。
将 🌷 细胞悬浮 🌳 液接种到含 FBS 的 αMEM 培 🌻 养基中。
在 37°C、5% CO2 培 🌳 养箱中 🐧 培养细胞。
3. 层 🐬 粘连 🌺 分离
培养 12 天后，将细胞悬浮液转移到 🪴 新鲜的培养基中。
将细胞悬浮液分层接种到附着于培养皿的培 🐧 养 🐅 基上。
在 37°C、5% CO2 培养箱中培养细胞 🌷 23 周。
4. 密度梯 🌼 度离 🐎 心分离
将培养过的细胞悬浮 🦢 液收集 🕷 起来。
使 🍁 用已 🦈 知密度梯度的离心液 🦁 制备密度梯度液。
将细 🦆 胞悬浮液分层添加到密度梯度 🌵 液 🌳 中。
进行离 🦋 心以分离细胞。最重的细胞（即牙髓干细胞）将。沉淀 🐝 在梯度 🐵 的底部
5. 流 🐼 式细 🌸 胞仪分选 🌵
收集 🐞 密度梯度 🐟 离心的沉淀物。
用抗 🌿 体 🐛 （如 CD34、Stro1）标记细 🐶 胞。
使用流式 🪴 细胞仪分选出阳性的牙 🌼 髓干细胞。
培养 🐺 和 🐧 鉴 🦢 定：
将分离出的牙 💐 髓干细胞接 🐦 种在含的 FBS 培 αMEM 养 🌼 基中。
在 37°C、5% CO2 培养箱中培养 🐈 细胞 🐎 。
使用免疫 🦈 细胞化学染色或流式细胞术对细胞进行 🦋 鉴定 🦋 ，检测牙髓干细胞标记物（如 CD34、Stro1、CD45）。
注释：本方法可分离出大鼠牙髓干细胞 🐛 。
培养基和胰蛋白酶/胶原酶浓度可能需要根 🐼 据特定牙齿类型进行优化。
培养期间应监测细胞生长 🕸 和形态，以确保培养物的 🐕 质量。
4、牙髓干 ☘ 细胞的四大优势
牙髓干细胞的四大优势 🌴 ：
1. 丰富的多能性：牙髓干细胞具有分化为神经元、成、骨细胞脂 🦍 肪细 🦁 胞和 🐵 牙本质成形细胞等多种细胞类型的潜力，这使其成为组织修复和再生治疗的有力候选者。
2. 易于获取：牙髓干细胞可以从拔除 🌷 的智齿或乳牙中提取，是一种方 🐡 便且无痛的方 🕸 法。与其他类型的干细胞来源（如骨髓）相，比。它是一种较不侵入性的程序
3. 免疫原性低：牙髓干细胞具有较低的免疫原性，使其移植后被排斥的风险较低。这使得它们成为异体移植（从捐赠者获得的细胞的）潜。在候选 🐳 者
4. 神经保护特性：牙髓干 🪴 细胞已显示出神经保护特性，可以通过释放神经生长因子和抗氧化剂来促进神经再生和修复。这。使得它们在治疗神经系统疾病和损伤中具有潜力
