🌷 老鼠骨髓干细胞提取（如何检 🐠 测小鼠骨髓干细胞的活性）
- 作者: 胡苡澄
- 来源: 投稿
- 2025-09-09
1、老鼠骨髓干细 🌾 胞提 🐎 取
老鼠骨髓干细胞提取步骤 🐝
材料：老鼠
无菌注 🐴 射器和针 🌴 头
肝素PBS（磷酸 🐧 盐缓冲 🦆 液 🌵 ）
培养基培养皿
步骤：
1. 准备 🌺 老鼠
对老 🐦 鼠进行麻醉 🐈 。
剃 🐘 除 🌷 腿部毛发 🦈 ，并在酒精中消毒。
2. 骨 🌷 髓 🌳 抽 🐎 取
使用无菌注 🐬 射器和针头，刺入 🐕 老鼠的胫骨或股骨。
小心抽 🦆 取骨髓。
肝素 🐠 可 🐞 作为抗凝剂加 🍀 入到注射器中。
3. 骨髓悬 🐼 液 🐅 处理 🐧
将骨髓悬液加入到含有 PBS 的培养皿中 🌺 。
离 🐕 心 🐝 5 分钟，速度为 200 x g。
小心吸 🐼 除上清液，不要扰动细胞沉淀。
4. 红细 🌴 胞裂解 🐱
加 🐠 入红细胞裂解缓冲液（如 🌴 BD Pharm Lyse）到细胞沉淀中。
按制造商的说明孵 🐘 育。
5. 离 🐛 心和洗涤
再 🐈 次离心 5 分钟 🌳 ，速度为 🐘 200 x g。
小心吸除上清 🐧 液。
加入 PBS，涡，旋混 🐟 匀然后再次离心。
重复洗涤步骤，直至上 🐛 清液变清。
6. 细 🌷 胞 🌻 计数 🐴 和培养
对细胞沉 🐵 淀进行计 🍁 数 🌼 。
将细胞悬液接种 🐘 到含有 🐛 适当培 🦁 养基的培养皿中。
将 🐬 培养皿置于 37°C、5% CO? 的 ☘ 培养箱中 🪴 培养。
提示：使用无菌 🐱 技术 🐶 进行所有步骤 🐅 。
骨髓细胞提取 ☘ 率因老鼠的品种和年龄而异。
用荧光激活细胞分选（FACS）或免疫磁珠分选等方法可以 🐈 进一步富集或纯化干细胞。
2、如何检测小鼠骨 🐬 髓干细胞的活 🕸 性
检测小鼠骨髓 🦟 干细胞 (BMSC) 活性的方法 🐝
1. 集落形成单位成纤维细胞 (CFUF) 检 🦄 测
原理：单一的 BMSC 有 🌺 能力 🌷 在培养基中增殖并形成成纤维细胞集落。
方法：将 BMSC 悬液接种到培养基中，并培养 1014 天。用，甲。苯蓝染色集落并计数每个集落代表一 🌷 个有活性的 BMSC。
2. 集落形成单位成 🦟 骨 🦢 细 🌷 胞 (CFUO) 检测
原理：单一的 BMSC 有能力在培养基中分化为成骨细胞并形成含钙 🦆 矿 🦋 物质的结节。
方法：将 BMSC 悬液接种到含骨诱导因子的培养基中，并培养 23 周。用，茜。素红染色结节并计数每个结节代表一个有活性 🍀 的 BMSC。
3. 集落 🐕 形成单位 🦅 软 🐴 骨细胞 (CFUC) 检测
原理：单一的 BMSC 有能力在培养基中分化为软 🌹 骨细胞并形成含透明软骨的结节。
方法：将 BMSC 悬 🐵 液接种到含有透明软骨诱导因子的培养基中，并培养 23 周。用，阿。尔新蓝染色结节并计数每个结节代表一个有活性的 BMSC。
4. 黏附试 🐅 验
原理：BMSC 具有黏附在培养皿表面上的 🌵 特性。
方法：将 BMSC 悬液接种到培养皿中，并孵育 1 小时 🌲 。用 PBS 洗。涤培养皿，以。去 BMSC 除。未黏附的细胞用甲苯蓝染色黏附的细 🐅 胞并计数黏附的细胞比例反映了的 🐟 活性
5. 流式细 🐛 胞 🌲 术分选 🦉
原理：使用特异性抗体标记 🐋 BMSC 表 🐧 面上的标记物，如 Sca1、CD44 和 CD90。
方法：将 BMSC 悬液与抗体孵育，然后用流式细胞术机分选出表达目标标记物的 🌵 细胞分选的细胞。可。以用于后续的活性检测或研究
6. 转基因报 🐋 告系 🌿 统 🐅
原理：使用转基因小鼠，其 🍁 中 BMSC 特异性启动子驱动报告基因（例如 GFP 或萤光素酶）的表达。
方法：采集转基因小鼠的骨髓，并分析报告基因的表达水平报告基因的表达水 🕷 平。与的 BMSC 活。性相 🌷 关
7. 体内 🍀 移植试验 💐
原理：将 BMSC 移植到免疫 🌴 缺陷小鼠中，并观察其分化为 🌷 骨 🌿 、软骨或脂肪的能力。
方法：将 BMSC 悬液注射到免疫缺陷小鼠的皮下 🌾 或 🐼 骨骼中。一段时间后，取 BMSC 出。移 BMSC 植。部位并分析的分化情况体内的分化能力可以反映的活性
3、大鼠 🐝 骨髓间充质干细胞提取
大鼠骨髓间充质干细胞 🐠 （BMSC）提取
材料：68 周 🌼 龄 🌹 大鼠 💐
无菌手术 🐦 器械
Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培 🐼 养基，含 10% 胎 🕷 牛 🦅 血清 (FBS)
磷酸缓 🐧 冲 🪴 盐溶液 (PBS)
胶 🦊 原 🐦 酶 🐞 II
胰蛋 🐎 白酶 ☘ EDTA 溶液
15 ml 和 🦉 50 ml 离 🕸 心管
细胞 🐵 培养瓶或孔板
方法：1. 取 🐱 骨 🌼 髓 🕸 ：
对大 🐕 鼠 🦉 实 ☘ 施麻醉。
用 70% 乙醇 🦉 擦拭股骨和 🐬 胫骨。
在无菌条件下在，股骨和胫骨两端 🐟 各做一个切口。
用 🦆 注射器和 18 号 🐧 针从骨髓腔中 🌼 抽出骨髓。
2. 消化 🦊 细 🌵 胞 🐞 ：
将骨髓转移到 🐋 50 ml 离心管中，用 PBS 洗涤两次。
加入 🦈 10 ml 胶原酶 II (100 U/ml) 溶液，在 37°C 孵育 1 小，时摇动混合。
离心 🐯 10 分 🐱 钟 🌹 ，1500 rpm。
3. 去除 🌴 红细胞：
弃去上清 🐝 液，用 🐺 PBS 洗涤细胞两 🦈 次。
加入 10 ml 1x 红细胞裂解缓 🌴 冲液，室 10 温孵 🌹 育分钟 🐦 。
离心 5 分 🌷 钟 🐘 ，1500 rpm。
4. 分 🐅 离 🌷 BMSC：
弃去上清液，用 DMEM 培养 🐴 基悬浮 🪴 细胞 🦍 。
将细胞悬液转移到新的 ☘ 50 ml 离心管中，并用 🦁 DMEM 培养 🌿 基补足至 50 ml。
离 🌷 心 10 分 🐛 钟 🌹 ，1500 rpm。
收集上层细胞 🌲 悬液，并，将其转移到培养瓶或孔 🐅 板中用培养 DMEM 基覆盖。
5. 培 🐦 养 🦅 BMSC：
将培养 🐧 物置于 37°C、5% CO2 孵箱中培养。
每 34 天 🐡 换一次培养 🐶 基。
提示：在无菌条件下进行所有 🐘 操作 🐳 。
使 🦢 用新鲜 🌺 骨髓提取 BMSC。
BMSC 可以贴 🐡 壁生 🌺 长，成 🐱 纤维样形态。
BMSC 可通过 flow 细胞术或免疫细 🐦 胞化学染色鉴 🐠 定。
4、老鼠 🌳 骨 🌿 髓干细胞提取方法
老鼠 🐶 骨髓 🐴 干细胞提取方法
材料：老鼠
无 🌿 菌 🌳 手术器械
培 🌹 养 🌼 液 🌲 （Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）
抗 🦁 生素 🌳 （青霉素/链霉素）
肝素细胞收集管 🐛
离心机步骤：
1. 准备老 🌾 鼠：
给予老鼠麻 🐺 醉 🦋 。
消毒 🪴 手术部 💮 位（通常为两条后腿）。
2. 切取股 🌹 骨 🦈 ：
用 🐦 无 🌸 菌剪刀 🌿 剪开皮毛。
用 🐼 止血钳提起皮肤和肌肉，露出股骨。
用无菌镊子轻轻剪开股骨两端，释 🐕 放骨 🐠 髓 🕷 。
3. 冲 🐟 洗骨 🐎 髓 🐳 ：
用装有 DMEM + 抗 + 生素 🐎 肝素的无 🐧 菌注射器冲洗股骨，收集骨髓悬液。
4. 离 🐋 心 🐦 ：
将骨髓 🌼 悬 🌵 液转 🐝 移到细胞收集管中。
离心 10 分 🐕 钟，1500 rpm。
5. 上清液弃去 🌺 ：
小心弃去上 🐬 清液，保 🕸 留 🦉 沉淀的细胞。
6. 重悬 🐼 细 🦈 胞：
用 DMEM + 抗生素重悬 🌷 细胞。
7. 计数 🕷 和接 🐛 种：
计数细胞数量并接种 🐋 到合适的培 🦆 养物皿中 🐎 。
提示：使 🐵 用无菌技术至关 🌷 重要，以防止 💮 污染。
为了获得 💮 高质量的干细胞 🦉 ，建议使 🦍 用年轻、健康的老鼠。
肝素可 🐞 防 🦍 止细胞凝集。
具体步骤 🐦 可能因实验室协议 🌷 而异。
