大 🐠 鼠肌腱干 🦁 细胞提取（小鼠神经干细胞提取方法）
- 作者: 郭沐恬
- 来源: 投稿
- 2025-04-23
1、大鼠 🐘 肌腱干细胞 🪴 提取
大 🦁 鼠 🐴 肌腱干细 🐼 胞提取
材料：大鼠 Achilles 肌 🐈 腱
PBS (磷酸缓冲盐溶 🕊 液 🍀 )
胶原 🐋 酶 🦁 IV
链霉素/青霉 🐕 素
FBS (胎 🦉 牛 🌼 血清)
DMEM 低糖培养 🐝 基 🦉
培养板和培 🐟 养瓶
步骤：1. 肌 🌹 腱分 🕊 离 🕸 ：
从大 🌻 鼠 🦢 处取出 Achilles 肌腱。
用 PBS 冲 🐅 洗干 🕸 净 🐴 。
2. 胶原酶 🦊 消化：
将肌腱 🕸 切成 🐒 小块 (约 1 mm3)。
将肌 🌷 腱块转移到含有胶 🦅 原酶 IV (1 mg/mL) 的消化缓冲液中。
在 🐵 37°C 下孵育 12 小时，偶尔振摇。
3. 离心和过滤 🦉 ：
将消 🐼 化后的 🐞 悬液离心 5 分钟，1000g。
用 70 μm 细胞过滤 🦊 器过滤悬浮液。
4. 细胞 🐬 培养：
将过滤后的悬浮液转移到含 10% FBS 和 🐈 1% 链霉素/青霉素的 DMEM 低糖培养基中 🌴 。
将细胞接种到培养板或培养瓶中 🐎 。
在 37°C、5% CO? 的潮 🌹 湿环境中培养。
5. 培 🌴 养基更换：
每 23 天 💐 更换培养基。
6. 通 🐦 路和增殖：
观察细胞 🐝 形态和增殖率。
使用免疫细 🦢 胞化学或流式细胞术对干细胞标 🐵 记物（如 Sca1、CD44）进行分析。
注意：处 🌿 理动物 🕷 时应遵 🐶 循机构的准则。
维持无 🌹 菌环境至关 🐅 重要。
根据实际情况调整 🪴 胶原酶消化时间。
2、小 🌷 鼠神经干细胞提取方法
小鼠神经干细胞提取 🦅 方法
材料成年小 🐕 鼠（68 周龄）
无菌器 🐠 械
Hank's 平衡 🦊 盐 🪴 溶液 🐅 (HBSS)
帕帕因溶 🌸 液
Meckel's 硬 🌸 脑 🐴 膜液（MEM）含 10% FBS、1% 葡萄糖
神 🦅 经干细 🐎 胞培养基 🕊
神经干 🌹 细胞贴附培养基
离心机培养皿和培 🌷 养瓶
CO2 培 🦅 养 🦆 箱 🐞 （37°C，5% CO2）
步骤1. 准备 🦟 好小鼠：麻醉小鼠并 🦊 通过腹主动脉穿刺取 🐝 血。
2. 分离脑：颈 🌾 椎脱臼小鼠，消，毒头皮并小心打开颅骨。取，出大 🐋 脑放入盛有无菌 HBSS 的。培养皿中
3. 去除脑膜：用显微镜观察，小心地使用镊子去除大脑的脑 🌵 膜。
4. 消 🐛 化脑组织：将大脑切成小块，转移到含有帕帕因溶液的 🦋 培养皿中。在 37°C 下孵育 30 分，钟每分钟 10 振。荡一次
5. 分 🐛 离 💮 单细胞：用预冷的 MEM 终止帕帕因 🦢 消化，并用移液枪剧烈吹打细胞悬液。将细胞，悬液。过滤以去除任何团块或组织碎片
6. 离心和收集细 🦊 胞：将细胞悬液在 1200 rpm 下离心 5 分钟。小心地吸出上清 🦊 液，并。用神经 🐈 过干细胞培养基重悬细胞沉淀
7. 去除微胶细胞：将细 🌾 胞悬液接种到预先涂有聚赖氨酸的培养瓶中，并在 37°C、5% CO2 下孵育过夜微胶细胞 🦈 。会，附。着在培养瓶上而神经干细胞会悬浮在培养基中
8. 收集神经干细胞：小心地收集悬浮 💐 的神经干细胞培养基，并，将其转移到新的培养瓶或培养皿中使其 🦉 附着于涂有层粘连蛋白 🌵 或聚赖氨酸的表面。
9. 纯化神经干细胞：使用神经干细胞标记物（如 Nestin 或 Sox2）和 FACS 分选来 🦉 纯化神经干细胞。
培 🌹 养 🍁 神经 🦁 干细胞
神经干细胞可以在神经干细胞培养基中生 🦟 长，其中含有生长因子如 EGF 和 FGF2。
定期更换培养基以保持细胞 🦢 健康。
神经干 🐳 细胞可以在 37°C、5% CO2 条件下培养数周。
3、大鼠间充质干细胞提 🕊 取
大鼠间充质干 🦆 细胞 🐟 提取
材料：大 🍁 鼠骨髓或脂肪 🐱 组织
无血清 🐝 培养基（如含 🌿 抗生素的 🌵 DMEM）
梯度离心液（如 🌸 FicollPaque）
培养瓶细胞刮 🌾 刀
胰蛋 🦆 白酶溶液
培养基（如含血清 🌲 的 DMEM）
步骤：1. 组织 💮 采 🌳 集 🕸 ：
从大鼠 🐴 胫骨或 🐵 股骨采 🌷 集骨髓。
从大鼠腹部或背部 🌵 采集脂肪组 🐠 织。
2. 单核 🦆 细胞 🦍 分离：
将 🐈 组织研磨成单细胞悬液。
用梯度离心液分离单核细胞单 🌵 核细 🌷 胞。将。位于界面处
收 💮 集单核细胞 🌷 并用无血清培养基洗涤 🐧 。
3. 培养塑料貼附 🐕 ：
将单 🌻 核 🦁 细胞悬 🦍 液接种到培养瓶中。
加入培养基，并 💮 置于 🐯 37°C、5% CO2 的培养箱 🦟 中。
4. 培养和 🌳 传代 🦢 ：
每 34 天更换一次培 🐺 养基。
当 ☘ 细胞达到 8090% 融合时，用胰蛋白酶溶液消化细 🐎 胞。
将 🌸 细胞传代到 🦁 新的培养瓶中 🌵 。
5. 分化鉴定 🐧 ：
在适当条件下培养间充质干 🌲 细胞以使其 🐋 分化为脂肪细胞、软骨细胞或骨 🦅 细胞。
通过染色 🐴 或免 🐦 疫荧光技术鉴定 🐛 分化细胞。
提示：使用新鲜组织 🦋 以提高细胞 🐈 存活率。
仔细控制培养环境以优 🦈 化细胞生长 🍁 。
使用纯 🌹 化步骤以去除杂质细胞。
及时传代细胞 🌳 以 🌷 防 🌵 止过密。
根据预期用途调整培 🌳 养和分化条件。
4、小鼠脂肪干细胞 🐯 提 🌴 取
小鼠 🐝 脂 🐧 肪干 🍀 细胞提取
材料68 周 💐 龄小 🍁 鼠 23 只 🐯
无菌手 🐵 术器械 🐟
无菌培 🐼 养 🐋 液
无菌培 🐯 养基 🐘
胶 🌺 原酶消化液
碘伏 🦊 （75%）
乙 🐟 醇（70%）
步骤1. 手术准 🐱 备 🐶
给小鼠注射麻醉剂（例 🐳 如氯胺酮 🦍 ）
用碘伏和乙醇消毒 🐎 手 🌾 术部位（腹部）
2. 脂肪组织 🍀 采集
用消毒剪 🌼 刀和镊子沿手 🐝 术部位 🌹 侧面切开皮肤和肌肉
暴露脂肪组织，小心不要损坏 🐕 组织
用小 🐳 镊子轻轻夹住脂肪组织小，心剥离周围组织
3. 脂肪 🌸 组织消化 🦈
将脂肪 🌳 组织放入无 🍀 菌培养液中
加入胶原酶消化液（例如胶原酶，每 IV，2 mg/ml），克脂肪组 🦄 织 1 ml
在 37°C 恒温摇床上孵育 🌷 45 分钟
每隔 15 分钟用移液 🦊 枪轻轻 🐒 搅拌组织，以帮助消化
4. 脂肪干细 🦍 胞分 🦊 离
孵育后，用无菌培养 🦊 液冲洗脂肪组织 23 次，以去除胶原酶 🐦
将冲洗 🐛 后的脂肪组织 🌵 转移 🐒 到 50 ml 离心管中
加入等量的无菌培 🕷 养基
1000 × g 离心 🌵 10 分 🐈 钟 🌷
吸出 🐕 上清液，收集离心后的细胞沉淀
5. 培 🌼 养 🐒
将 🌸 细胞沉淀重悬在无菌培养 🌻 基中，并接种到培养皿中
将培养皿置于 37°C、5% CO2 恒温培养 🐘 箱中
6. 扩增 🕸
每 🦢 23 天更换一次培养基
当细胞 🐯 达到 8090% 的汇 🐅 合度时，进行传代
用胰蛋白酶消化细胞 🐞 ，然后传代到新的培养皿中
提示确保所有 🐶 器械和培养液都无菌
小 🐵 心操作 🦢 ，避免 🦍 损坏细胞
定期监测细胞生长，防止 🦊 过 🐱 度汇合
细胞提取和培养的时间和温度可能因胶原酶和培养基的不同而 🕷 异。
