人脂肪干细胞制备方法（诱导多能干细胞制备方法）
- 作者: 朱清妤
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、人脂肪干细胞制备方法
人脂肪干细胞制备方法
材料：新鲜脂肪组织（通常取自腹部或大腿）
脂肪酶溶液
PBS（磷酸盐缓冲液）
培养基（含 FBS）
离心机培养皿或培养瓶
细胞计数器
步骤：1. 收集脂肪组织：
在无菌条件下，从供体中切取脂肪组织（约 50100 克）。
立即将其放入含抗生素的 PBS 中。
2. 消化脂肪组织：
将脂肪组织切成小块。
将脂肪酶溶液加入组织中，按照制造商的说明进行消化（通常为 12 小时，37°C）。
3. 离心分离：
消化后，将悬液高速离心（1200 x g，10 分钟），形成三层：上层脂肪、中间层干细胞和下层液体。
小心地吸取中层细胞。
4. 洗涤和离心：
用 PBS 洗涤离心分离后的细胞。
再次高速离心（1200 x g，10 分钟），除去残留的脂肪。
5. 悬浮和计数细胞：
将细胞悬浮在培养基中。
使用细胞计数器计数细胞。
6. 培养干细胞：
将细胞接种到培养皿或培养瓶中，浓度为每平方厘米 个细胞。
培养细胞于 37°C、5% CO2 的培养箱中。
提示：使用新鲜的脂肪组织，因为冷冻脂肪组织的干细胞存活率会降低。
注意无菌操作，以防止细胞污染。
培养基应定期更换（每 23 天）。
当细胞长到 7080% confluency 时，可以进行传代。
2、诱导多能干细胞制备方法
诱导多能干细胞 (iPSC) 制备方法
1. 细胞重编程技术
逆转录病毒转染：使用逆转录病毒载体表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc 基因，将体细胞重编程为 iPSC。
慢病毒转染：类似于逆转录病毒，但安全性更高，因为整合风险较低。
腺病毒转染：使用腺病毒载体携带重编程因子，在短暂表达后不需要整合到基因组中。
转座子转染：使用转座子系统，将重编程因子随机整合到基因组中。
2. 非整合技术
mRNA 转染：使用 mRNA 转染体细胞细胞质，暂时表达重编程因子而不整合到基因组中。
蛋白质转染：将重编程因子蛋白直接转导到体细胞中，从而绕过 DNA 整合。
小分子化合物：使用小分子化合物，如 Valproic 酸或 PD，辅助重编程过程，降低整合风险。
3. 优化培养条件
培养基：含 bFGF、LIF 和/或转录抑制剂等生长因子的特殊培养基促进 iPSC 自更新。
培养基底物：Matrigel 或其他基底物提供细胞粘附和增殖的基架。
培养条件：细胞培养在 37°C、5% CO2 环境下。
4. 筛选和鉴定
形态学筛选：iPSC 具有胚胎干细胞 (ESC) 样的形态学特征，如紧密包装的细胞群体。
特异性标记：iPSC 表达 ESC 特异性标记，如 SSEA3、Tra160 和 Oct4。
分化潜能：iPSC 能够分化为三个胚层 (外胚层、中胚层和内胚层) 的细胞类型。
5. 临床应用
疾病建模：iPSC 可用于生成特定患者细胞的疾病模型，以研究疾病机制和治疗策略。
再生医学：iPSC 可分化为组织或器官，用于移植治疗，如帕金森病、视网膜变性等。
药物筛选：iPSC 可用于筛选新药和评估药物对特定患者的影响。
3、静脉脂肪乳剂制备方法
静脉脂肪乳剂制备方法
材料：20% 静脉脂肪乳剂
无菌注射用水
无菌注射瓶和塞子
输液袋输液泵
步骤：
1. 准备注射瓶和塞子
将无菌注射瓶和塞子放在无菌工作台上。
2. 计算所需体积
根据患者的体重和需要，计算所需静脉脂肪乳剂的体积。
3. 稀释静脉脂肪乳剂
使用无菌注射器从 20% 静脉脂肪乳剂瓶中提取所需的体积。
将所提取的静脉脂肪乳剂注射到注射瓶中。
使用无菌注射器向注射瓶中添加无菌注射用水，直到达到所需的最终体积。
4. 搅拌混合物
将注射瓶盖上塞子。
轻轻摇晃注射瓶，以彻底混合静脉脂肪乳剂和注射用水。
5. 抽取到输液袋
使用无菌输液管将注射瓶与输液袋连接。
打开输液袋夹子，将静脉脂肪乳剂从注射瓶抽入输液袋中。
6. 设置输液泵
将输液袋悬挂在输液架上。
设置输液泵，以指定的速率输注静脉脂肪乳剂。
7. 输注
开始输注静脉脂肪乳剂。
持续监测患者的反应，并根据需要调整输注速率。
注意事项：
必须使用无菌技术进行整个过程。
输注前必须检查静脉脂肪乳剂是否出现凝集或变色。
输注过快可能导致高脂血症。
输注前和输注过程中应密切监测患者的病情。
