如 🐳 何培养 🕊 胚胎干细胞（胚胎干细胞培养鉴定的方法）
- 作者: 陈煜泽
- 来源: 投稿
- 2025-08-27
1、如何培养 🦁 胚胎干细 💐 胞
如何培 🦟 养胚胎干细胞
材料：胚 💐 胎干细 🍀 胞 🐘 系
无血清 🪴 培养 🌸 基（ESDM 或 DMEM/F12）
纤维 🐟 连接 🦈 蛋 🦟 白涂层培养皿或培养瓶
L谷氨 🪴 酰 🦉 胺（2mM）
β巯 🦟 基乙醇 🐝 （0.1mM）
非必 🌸 需氨 🌳 基 🐳 酸
LIF（或其他生 🐺 长因子 🌳 ）
步骤：1. 细胞 🐞 解 🦁 冻：
从液氮 🦄 中取出细胞，快速解冻于 37°C 水浴中。
将细胞转移到装有培养基的 🦅 离心 🌳 管中，并以离心 300 x g 分 5 钟。
2. 重悬 🦢 细胞：
小 🦄 心吸 🐈 出上清液 🐼 。
用 💮 ESDM 或 DMEM/F12 重悬细胞，每 🦅 100 个培养皿或培养瓶 🦁 约个细胞 1 x 10^6 。
3. 播种 🐺 细胞 🐅 ：
将细胞悬液转移到预先涂层的培养皿 🐴 或培养瓶中 🌸 。
轻柔地摇动培养皿或 🐝 培养瓶以均匀 💐 分布细胞。
每孔或瓶中 🌵 加入 1015mL 培养 🦁 基。
4. 培 🦆 养 🌾 细胞 🌼 ：
将细 🦈 胞置于 37°C、5% CO2 孵育器 🦟 中孵育。
每 23 天更 💐 换培养基。
根据需要添 💮 加 LIF 或其他生长因子。
提示：使用无血清培养基，以避免分化因子 🌺 或生长 🌵 抑制剂的 🐦 污染。
纤维连接蛋白涂层有助于 🌷 细胞贴壁并促进增殖。
培养基应补充 L谷氨酰胺、β巯基 ☘ 乙醇和非必需氨基酸，以支持细胞 🐒 生长。
LIF 是胚胎干细胞 🕊 生长和维持自我 🌴 更新所必需的 🕷 细胞因子。
定期监测细胞 🐶 形态 🐯 ，并通过传代保持其增殖能力。
警告：胚胎干细胞具有致 🦈 瘤性，因此在处理时应格外小心。
按照预先建立 🐴 的生物安 ☘ 全协议处理细胞。
丢弃 🍀 所有含有 💮 细胞材料的废物。
2、胚胎 🐵 干细胞培养鉴定的 🦢 方法
胚胎干细 🦅 胞培养鉴定 🐋 的方法
1. 形 🦆 态 🐱 学鉴定
胚胎 🦊 干细胞呈圆形或卵圆形细胞，大小均匀。
细胞核位于中央核，仁明 🦉 显。
细胞之 🦟 间紧密连接 🦊 ，形成紧凑的克 🐋 隆。
2. 表面标志物 🐬 检测
免疫荧光法：使 🐯 用特异性抗体检测胚胎干细胞表面抗原，如：
Oct4
Sox2
Nanog
SSEA4
流式细胞 🕷 术：通过荧光标记的抗体检测细胞表面标志物 🕊 的表达水平。
3. 自 🐎 我更新能力鉴定 🐛
克隆形成 🦄 实验：将胚 🐵 胎干细胞分散成单细胞并在培养基中培养，观察其能否形成新的 🦢 克隆。
长传代培养：持续传代胚胎干细胞，观察其是否保持其增殖和分化能 🐴 力。
4. 多向 🐦 分化潜 🐦 能鉴定
体外分化：将胚胎干细胞诱导分化为不同类型细胞（如神经元、心、肌细胞骨骼细胞），观察其表达特异 🌹 性标记物。
畸胎瘤形成试验：将胚胎干细胞注射 🐛 到免疫缺陷小鼠体内，观察其是否形成含有各种组织类型的畸胎瘤。
5. 基因表达 🐛 分析
实 🐎 时定量PCR：检测胚胎干细胞 🐎 中核心基因（如 Oct4、Sox2 等）的表达水平。
微阵列 🐞 分析分析：胚胎干细胞整体基因表达 🐦 谱，鉴定特征 🐈 性基因表达模式。
6. 染色 🐅 体分 🐦 析 🦅
核型分析：对胚胎干细胞进行染色体分 🦊 析，以确定其 🕸 染 🐵 色体数目和结构是否正常。
比较基因组杂交（CGH）：检测胚 🐈 胎干细胞基因组中的拷 🐟 贝数变异（CNV）。
7. 功能性 🦋 分析
电生理学分析 🕊 ：检测分化出的神经元是否具有 🕸 电 🌴 活性。
收缩力分析：检测分化出的 ☘ 心肌细 🐝 胞是否具有收缩功能。
通过结合多种鉴定方 🐞 法，可，以全面评估胚胎干 🌻 细胞的特性和质量以确保其用于研究或临床应用的安全性和有效性。
3、如何培养胚胎干细胞 🐵 的方法
培养胚胎 🌼 干 🦈 细胞的方法 🌼
材料：无血清培 🐘 养基（例如 DMEM/F12 + N2 + B27）
胚 🐝 胎 🐳 干细 🌻 胞
培养板或培养瓶，表面涂 🐝 有明胶或聚赖氨酸
37°C 孵化器 🐟 ，5% CO2，95% 湿度
步骤：1. 解冻胚胎干细胞：将冷冻的胚胎干细胞快速解冻至 37°C，然后用无血清培 🌸 养基洗涤两次。
2. 接种胚胎干细 🦈 胞：将胚胎干细胞悬浮在无血清培养基 🐡 中并接种到表面涂有明胶或聚赖氨酸的培养 🌷 板或培养瓶中接种。密。度取决于细胞类型和培养条件
3. 培养：将 🦢 细胞置于 37°C 孵化 🦊 器中，5% CO2，95% 湿度 🌸 。
4. 传代：当细胞达到 8090% 的汇合度时，使用细胞解离 🕸 液（例如胰蛋白酶传代）培养。将细胞，从，培养。板或培养瓶中分离出来稀释成所需的密度并重新接种到新的培养板或培养瓶中
5. 冷冻保存：为了长期保存，胚胎干细胞可以冷冻在含 DMSO 的培养基中。将 🌻 ，细胞悬浮 🌼 在冷冻液中分步降温至 80°C，然。后储存液氮中
注 🌴 意事 🐝 项 ☘ ：
保持培养 🦆 条件 🐳 的恒定（温 🐬 度、CO2、湿度）。
定期更 💐 换培养 🐡 基以去除废 🦟 弃物并补充营养。
仔细 🦆 监测细胞生长以防 🦄 止过密或过度生长。
避免污染，使用无菌技术并及 🌾 时检 🐟 测污染物。
培养胚胎干细 🌳 胞时需要适当的生物安全措施。
提示：不 🦢 同类型的胚胎干细 🌻 胞可能需要特定的补充剂或生长因子。
培养胚胎干细胞可能需要反复实 🐵 验以优化条 🌲 件。
建议与经验丰富的胚胎干细胞培养人员咨询或进 🦆 行培训。
4、胚胎干 🌿 细胞培养的注意事项
胚胎干 🐧 细胞培 🌻 养的一般注意事 🐝 项
无菌条件：培养过程中始终保持无菌条 🐺 件至关重要，以防止污染。
培养基：使用专为胚胎干细胞培养而设计的培养 🍁 基，并定期更换。
培养温度：胚胎干细胞在37°C、5% CO2的孵箱中培 🦅 养。
培养容器：使 🦊 用无菌培养皿或悬浮培 🐈 养体系。
培养密度：维持细 🐧 胞生长所需的适 🐦 当培养密度，避免过度拥挤。
传代：当细胞生长至合适密度时 🐬 ，进行传代以维持细胞活力和避免分化。
转染和分化注 🦊 意 🦁 事 🐺 项
转 🕷 染试剂：选择与胚胎干细胞相容的 🐡 转 🦆 染试剂和方法。
分化诱导：遵循已建立 🐅 的方案分化胚胎干细胞，并仔细监控分化进度。
分化 🐡 标记：使用免疫荧光、流式细 🌼 胞术或RTPCR等方法检测分化标记物。
培养条件 🌹 监测和故障排除
细胞形态：定期观察细胞形态，以检测任何形态变化或污染 🦄 迹象 🌿 。
培 🐈 养 🦁 基变色培 🌴 养基变色：可能表明污染或培养基耗尽。
传代失败 🌻 传代失败：可能是由于细胞死亡、污染或培养条件 🌷 不当引起的。
分化异常分化异常：可能 🦍 是由于转染效率低、诱导条件不合适或细胞内在缺陷造成的。
其他 🦄 注意事 🐧 项
细胞特性：胚胎干细胞是多能的，具有分化成各种细胞类 🕷 型的潜力。因，此。在培养和分化过程 🦢 中仔细控 🐡 制细胞特性非常重要
伦理考虑：由于胚胎 🌿 干细胞的独特 🌷 特征，在使用和研究它们时要考虑伦理影响。
安全预防措施：遵守适当的生物安全预防措施，例如穿着实验室服和使用个 🪴 人防护装备。
