大鼠 🕊 脂肪干细胞实验步骤（大鼠脂肪干细胞实验步骤及结果）
- 作者: 李芸汐
- 来源: 投稿
- 2025-06-07
1、大 🐎 鼠脂肪干细 🐠 胞实验步骤
大鼠脂肪干细胞实验步 🦟 骤
收 🦈 集 🌷 脂肪组织
1. 为大鼠麻醉并保持无菌条件 🐯 。
2. 切开大鼠腹部皮肤，暴露脂 🌸 肪组织。
3. 用钝 🪴 器小心地收集脂肪组织，避免损坏组织。
分离脂 🍁 肪 🦁 干细胞
1. 使用胶原 ☘ 酶消化脂肪组织 🐧 。
2. 离心 🐒 分离悬浮液，得到含脂肪干细胞的沉淀。
3. 重悬沉淀并通过过滤去除 🐋 纤维和细胞碎片。
4. 使用流式细胞术或表 🕷 面标志物富 🐵 集脂肪干细 🐦 胞。
扩增脂肪 🌹 干 🦉 细胞
1. 将脂肪干细胞培养在富含生长因子的培养 🦁 基中。
2. 每隔 23 天更 🐋 换 💮 培养 🐕 基。
3. 当 🕷 细胞达到 8090% 的融合度时，传代细胞 🐦 。
鉴定 🐬 脂 🐵 肪干细胞
表 🦋 面标志物鉴定：
1. 流 🐦 式细胞术检 🌳 测脂肪干细胞表面 🌾 标志物，如 CD34、CD45、CD44 和 CD105。
分化 💐 潜 🌾 力鉴 🌼 定：
1. 将脂 💐 肪干细胞诱导向脂肪细胞分化，并用油红 O 染色 🌸 检测脂质积累。
2. 将脂肪干细胞诱导向骨细胞分化 🕊 ，并用茜素红染色检测钙化 🐋 。
3. 将脂肪干细胞诱导向软骨细胞分化，并用甲苯胺蓝染色检 🪴 测糖胺聚糖。
其他步骤（可 🦅 选）
基因表达分析：使用 RTPCR 或 qPCR 检测脂肪干细胞相关的基 💮 因表达。
免疫组化染色：使用 🐋 抗体对脂肪 🦁 干细胞标志物进行组织染色。
动物实验：将脂肪 🐶 干细胞移植到动物模型中，研究其治疗潜力。
注意事项保持 🦆 无 🐦 菌 🦄 条件。
在培养和实 💮 验过程中使用适当的对照。
参 🌵 考文献和遵循最佳实践指南。
2、大鼠 🌻 脂肪干细胞实验步骤 ☘ 及结果
大鼠脂 💐 肪 🦅 干 🐼 细胞实验步骤
材 🐞 料和 🐅 试剂
雄 🐺 性 SpragueDawley 大鼠，体重 200250 克 🍁
无菌生理盐 🌹 水
胶 🌳 原 💐 酶 🦄 IV
脂肪组 🐈 织 🐺 培 🌳 养基 (ADSC)
培 🌷 养皿和 💐 培养瓶
抗 🐕 生素抗/真 💮 菌 🐈 剂
胰 🐦 蛋 🌻 白酶 🦋 /EDTA
流式 🐈 细胞仪
特 🐘 异性细胞标记 💐 物抗 🌸 体
诱 💮 导分 🍀 化培养 🦟 基
步骤1. 脂肪组 🦋 织提取 🐯 ：
麻醉大鼠 🐞 并 💮 消毒手 🐱 术部位。
切开腹部并 🐬 小心取出腹膜后脂肪组织。
2. 胶原酶消 🌼 化：
将脂肪组织切成小块，加入含胶原酶 🌾 IV 的无菌生 🐶 理盐水中。
在 37°C 孵 🐘 育 12 小时，不断搅拌 🌸 。
3. 细胞收集和离心 🌻 ：
将消化液 🐈 过滤以去除未消化组 ☘ 织。
将过滤后的细胞液 🕊 离心 10 分钟，1200 rpm。
4. 脂肪 🌲 干细胞 🐼 分 🦄 离：
小心吸出上 🌴 清液，重 🐧 悬细胞于 ADSC 培养基中。
再次 🐒 离 🕷 心 10 分钟 🐈 ，1200 rpm。
吸 🐘 出上清液 🌴 ，收集细胞沉淀 🐅 。
5. 培养 🐋 ：
将脂肪干细胞接 🐞 种到培养皿中培养，基中加入抗生素抗/真菌剂。
将培养皿置于 37°C、5% CO2 孵箱 🦆 中培 🐝 养 🐈 。
6. 细胞 🦊 扩 🦈 增 🐡 ：
当细胞达 🐟 到 🐋 8090% 融合度时，用胰 🐡 蛋白酶/EDTA 消化细胞。
将细胞转移到新的培养瓶 🐬 中继续培 💐 养。
7. 细 💐 胞 🕷 表 🦉 征：
使用 🐱 流式细 🦢 胞仪分析细胞表型使用，特异性细胞标记物 🐴 抗体。
8. 分化诱 🌻 导：
将脂肪干细胞接种到培 🕷 养皿或培养瓶中，加入诱导分 💐 化培养基。
在 🌴 特定时间点评 🐎 估分化效率，使用相应的特异性标记物 🍀 。
结果脂 🐳 肪干细胞 🌷 分 🦋 离：
胶原酶消化后，从脂肪组织中成功分离出脂肪 🦍 干细胞 🐛 。
细 🌷 胞表 🦊 征 🐕 ：
流 🌴 式细胞仪分析显示分，离，的细胞 🌲 表达脂肪干细胞特异性标 🪴 记物如 CD29、CD34 和 CD90。
分化诱导 💐 ：
脂肪干 🐞 细胞在诱导分化培养基中 🐼 能有效分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞 🐟 。
通过油 🍀 红 O 染色、Alcian 蓝染色和染色 von Kossa 证实 🐵 了分化。
3、大鼠脂肪 ☘ 干细胞实验步骤图 🐘
大 🌼 鼠脂肪干细胞实验步骤图
材料：大 🐕 鼠脂肪组织
无菌 🦄 器皿和器具 🐴
培养 🦊 基（如 DMEM/F12）
抗生 🐶 素（如青霉素/链霉素）
胰 🌷 蛋 🌺 白酶 🌷
胶原酶红细胞 🌺 裂解液
细胞 🐕 培养瓶和 🐶 孔板 🌼
步骤：1. 取 🐈 材 🦍
将大鼠处死，取出皮下 🦅 脂肪组织。
2. 消 🦄 毒 🐯
将脂 🐡 肪组织用 70% 乙醇浸 🐘 泡 🌵 消毒。
3. 去除血管和结缔 🐶 组织
用剪刀和镊 🐦 子去除脂肪组织中的血管和结缔组织。
4. 切碎脂 ☘ 肪
将脂肪切成小块 🐳 (12 mm3)。
5. 消 🐵 化 🐼
将脂 🦆 肪小 🕊 块与胰蛋白酶和胶原酶混合，孵育 3060 分，钟直至脂肪 🌹 组织消化成单细胞悬液。
6. 过 🌸 滤 🐘
将细胞悬液通过 100 μm 滤 🪴 器过滤 🐬 。
7. 离 🐕 心
将细胞悬 🐅 液 🐞 以 300 x g 离心 5 分 🐛 钟。
8. 除 🐝 去红 🐟 细胞
将细胞沉 🌷 淀重悬于红细胞裂解液中，孵育 510 分钟。
9. 再次 🌿 离心
将细胞悬液以 300 x g 离心 5 分 🌷 钟 🦈 。
10. 培 🐯 养 🦉
将细胞沉淀 🦆 重悬于培养基中 🐧 。
将细 🦍 胞接种到细胞培 🌷 养瓶或孔 🐘 板中。
培养在 37°C、5% CO2 的 🌿 孵育箱中。
后 🕊 续步 🐎 骤 🦅 ：
细胞鉴定 🌿 ：使用特定标记物 🐦 （如 CD34、CD90）对脂肪干细胞进行免疫表型分析。
分化 🍀 诱导：将脂肪干细胞培养在特定的培养条件下诱导，其分化为脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞。
应用：研 🦢 究脂 💮 肪干细 🐋 胞在再生医学、组织工程和疾病治疗中的潜力。
4、大鼠脂肪间 🐒 充 🐛 质干细胞提取
大鼠脂肪间充质干细胞 🐺 提取 🐱
材料：成 🪴 年大鼠 🐡 （200300 克 🐺 ）
无菌手 🌿 术器械 🦅
生理盐 🐶 水
脂肪 🐼 组织收集袋
胶 🕸 原 🦈 酶 🐒 IV
培养基（含 🍀 10% FBS）
培养板细胞计数器 🌳
步骤：1. 取 🌸 材 🪴 ：
将 🦆 大鼠麻醉并消毒手术区域。
沿背部中线切开 🕊 皮肤和肌肉，暴露脂肪垫。
用无菌 🌷 手术剪小心翼翼地切除约 5 克脂肪组 🦆 织，放入收集袋中。
2. 消 🌷 化 🐦 ：
将脂肪组织转移到 🐈 无菌培养皿中。
加入等体积 🌵 的胶原酶 🐟 IV（1 mg/mL）溶液。
在 37°C 搅 🦍 拌 60 分钟。
3. 离心 🍀 ：
将消化后 🌾 的组织液转移到离心管中。
以 1200 rpm 离心 10 分钟 🐈 ，除去碎 🌿 片。
4. 培 🕷 养 🐱 ：
将上 💮 清液转移到新的 🕷 离心管中。
以 1500 rpm 离 🐴 心 10 分 🐶 钟，收 🐛 集细胞沉淀。
用培养基洗涤细胞沉淀，然后离 🐅 心 🐎 。
将细胞悬浮 🌷 在培养基中，接种到培 🐧 养板中。
在 🦍 37°C、5% CO2 环境下培养。
5. 鉴 🐦 定 🦆 ：
培养 🌲 34 天，观察细胞贴壁 🦆 生长情况。
使用流式 🌴 细胞术或免疫荧光染色等方法鉴定细胞为间充质干细胞（MSCs），例如 CD29、CD90 和 CD105 的表达。
注 🐝 意事项 🐛 ：
保 🦟 持无菌操作，以 🌾 防止 🐶 污染。
在整个过程中注意细 🐞 胞的活力 🌻 。
胶原酶 IV 溶液的浓度和消化时间根据 🐞 脂肪组织 🐶 的厚 🌷 度进行调整。
培养 🪴 基的成分和培养条件根据具体实验 🐦 目的进行优 ☘ 化。
