转染胚胎干细胞方法（胚胎干细胞法构建转基因 🐼 动物的过程）
- 作者: 胡艺澄
- 来源: 投稿
- 2025-04-18
1、转 🦆 染胚胎干细胞方法 🌸
转 🐴 染胚胎干细 🌳 胞的方法
转染是将外来DNA或RNA引入细胞的过程，胚胎干细胞 ☘ （ESC）由于其高增殖能力和分 🐺 化潜能而成为转染的理想靶标转染的。方ESC法 🌹 ，有。多种每种方法都有其独特的优点和缺点
病 🌹 毒载 🐱 体 🕷 递送：
慢病毒慢病毒：是一种逆转录病毒，可，以将外源基因整合到宿主细胞基因组 🌲 中实现长期、稳定的表达。适合。进行稳定细胞系构建 🌴
逆转录病毒逆转录病毒：与慢病毒类似，但整合到 🐵 宿主基因组中效率较低 🐱 。适合。瞬 🌼 时或中期表达
腺相关病毒腺相关病毒：是一种复制缺陷型病毒，不，整合 🦉 到宿主 🌹 基因组中但具有高转导效率。适合。短期或中等术语表达
非病毒载体递 🐒 送：
脂质体脂质体：是脂质 🌸 纳米粒子，可以包覆DNA或RNA分子并递送至细胞 🦆 内。由于 ESC 表，面。电荷负阳离子脂质体更适合转染
聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺：是一种带正电的聚合物，可以 🐈 与 DNA 或 RNA 形成复合物并递送至 🌻 细胞内。效，率。高但细胞毒性较高
电穿 🌷 孔电穿孔：是一种使用电脉冲暂时穿透细胞 🦋 膜，促进 DNA 或进 RNA 入细胞的过程。效 🌸 ，率。高但细胞毒性也较高
选择转染方法的 🪴 考虑因素：
表达水平和持续时间 🍀 ：病毒载体通常可实现更高的表达水平和更持久的表达，而非病毒载体通常提供 🐕 较低的表达和较短的持续时间。
整合风险：病毒载体整合到宿主基因组中，可能导致插入突变或基因表达干扰。非病毒载体，不整合因。此没有整合风 🍁 险
细胞毒性：某些转 🐅 染方法（如电穿孔 💮 ）可能对细胞造成伤害。选。择毒性较低的转染方法对于维持细胞活 🐈 力至关重要
成本和便利性：不同转染方法的成 🕸 本和便利性各不相同。应。根据研究需求和资源进行选择
优化转染 🌲 效率 🦊 的技巧：
优化 DNA 或 RNA 的质量和数量：高 🐴 纯度、低 DNA 内 RNA 毒素水平的或可提高转染效 🐵 率。
优化转染 🌾 条件转染：试剂、DNA 或 RNA 浓、度转染时间和细胞密度均会影响转染效率。根。据特定转染方法进行优化
使 🌹 用转染促进剂：某些化合物（如聚 🐶 己二 🐳 胺）可以促进 DNA 或 RNA 的细胞摄取和表达。
监 🌷 测转染效率：使用荧光或化学发光报告基因或抗体染 🌷 色来监测转染效率，以便进行优化和故障排除。
2、胚胎 🐞 干细胞法构建 🌼 转基因动物的过程
胚胎干 🕸 细胞法构 🐈 建转基 🌷 因动物的过程
1. 分离胚 🌲 胎 🐬 干细 🌳 胞
从受精卵中的胚泡内细 💮 胞团中提取胚 🐵 胎干细胞。
胚胎干细胞是未分化的多能 🦅 细胞能，够发育成所 🦈 有类型的细胞。
2. 引入 🕸 转基因 🐴
使用质 🍀 粒载 🌳 体将 🦍 目标基因导入胚胎干细胞中。
转基因通常包含感兴趣的 🐦 基因、合适的启动子 🦆 和选择标记。
3. 选 💐 择 🐬 转基因细 🐛 胞
转染胚胎干细胞后，使 🐺 用抗生素或荧光标记选择带有转基 🐵 因的细胞。
仅携带 🦆 转基因的细胞才能 🍁 存活并增殖。
4. 注射到胚胎中 🐋
将携带转基因的胚胎干细 🌲 胞注 🐞 射到受体胚胎中的囊胚腔内 🐟 。
这些细胞会整合到胚 🌿 胎发育中的 🌷 不同组织中。
5. 胚胎移 🐋 植
将注射后的胚胎移植到代孕母体中 🦆 。
胚 🌿 胎在代孕母体中发育为 🌸 胎儿，其中一些将携带转基因 🐕 。
6. 出生和 🦋 鉴定
转基因动物出生后，可，以通过多种技术对它们进行鉴定例 🌹 如 🦅 ：
尾部活检或血液 🐘 样 🐴 本的 DNA 分 🐺 析
特异性荧 🌴 光标记的检测
转基因 🦋 产物 🌺 的表达分 ☘ 析
7. 繁育 🐋
携带转基因 🦋 的动物可以 🌳 与其他动物交配，将转基因 передать给后代。
这 🐝 有助于建立稳定传递给后代的转基因动物品系。
3、胚胎干细胞法制备转基因小 🌳 鼠
胚胎 🐒 干细胞法制备转基因小 🐋 鼠 🐎
原理胚胎干 🦆 细胞法是一种生成转基因小鼠的技术。该方法涉及将外源基因导 🐞 入胚胎干细胞中，然，后。将，这。些细胞植入滋养细胞囊泡中从而产 🦉 生具有该外源基因的嵌合小鼠嵌合小鼠的生殖系细胞可能会携带外源基因进而产生带有该基因的转基因小鼠后代
步骤1. 胚胎干细胞 🦋 培养：从胚泡中分离胚胎 🐧 干细胞并将其培养在培养基中。
2. 外源基因导入：使用电穿孔、病毒转导或其他技术 🌹 将 🐛 外源基因导入胚胎干细胞中。
3. 筛选：使用抗生素筛选转基因 🦈 胚胎干 🐱 细 🌵 胞。
4. 注射：将转基因胚胎干细胞注射到滋养 🦅 细胞囊泡中。
5. 植入：将植入滋养细胞囊泡的胚胎干细胞植入假怀孕母鼠的子 🐠 宫中。
6. 筛选嵌合 🐳 小鼠：用PCR或其他 🐳 方法检测嵌合小 🐴 鼠的后代中是否存在外源基因。
7. 交配：将携带外源基因的 🍀 嵌合小鼠与野生型小鼠交配 🦋 。
8. 筛选转基因小鼠：检测后代中是否存在 🐴 外源基因，以识别转基因小 🐱 鼠。
优点可以 🌼 生成具有特定基因敲除或 🍀 突 🕷 变的小鼠模型。
可以研究基因功 🦁 能和疾病发病机 🦉 制。
可用于开发治疗方法和 🐡 药物筛选。
缺点耗 🐴 时且 🌴 成本 🌳 高。
可能产生嵌合小鼠 💐 ，需要进一步筛选以获得纯合子转基因小鼠。
可能存在免疫排斥和感 🐟 染 🦢 风险。
4、转染胚胎干细胞方法有 🌸 哪 🦍 些
转染胚胎干细胞的 🌺 方法 🐵
病毒载体逆转录病毒：可整合到宿主细胞基因组中，实，现长期转基因表达但具有插入 🕸 诱变风险。
腺相关病毒：具有良好的组织特 🦍 异性，低，免，疫原性可用于长期转基 🐦 因表达但转导效率较低。
慢 🕷 病毒：能有效转导静止细胞，具有，较高的转导效 💐 率但可能引起免疫反 💮 应。
非 🦢 病毒 💮 载体
脂质体：包裹DNA或RNA的脂质囊泡，能，通，过融合或内吞作用进入细胞但转导 🌳 效率较低不适用于长期转基因表达。
聚合 🐎 物 🐡 ：带有正电荷的聚合物，可与DNA或RNA结合，形，成复合物促进细胞摄取但毒性较高。
电穿孔：利用 🐟 高压电脉冲使细胞膜透 🦈 化，促进DNA或进 🐺 RNA入细胞，但可能导致细胞损伤。
其他方法微流控芯片：利用微流体原理，精，确控制细胞与转染试剂的相互作用提高转 🐒 导效率。
微注射：直接将DNA或 🌼 注射RNA入细胞质或细胞核，但，操作难度大可能损 🐴 伤细胞。
转座子：利用转座酶 🦁 介导的DNA插入，实，现高效的转基因表达但具有 🕊 脱靶风险。
选择 🐺 方法的考虑 🐺 因素
转 🦆 染 🐼 效率 🐋
转基因 🌴 表达 🌺 稳 🐬 定性
细 🐺 胞毒性 🐅
免疫 🐵 原 💮 性 🦈
成本和操作难度 💐
