肠 🦋 道干细胞如何培养（肠道干细胞培养过 🐴 程中细胞中间泛黑）
- 作者: 郭颜落
- 来源: 投稿
- 2025-05-23
1、肠道干细胞如何培 🌵 养
肠道干细胞培 🌴 养方法
1. 组织采集和分 🐴 离 💮
从 🦟 新鲜的小鼠 🐼 或 🌷 人肠组织采集样本。
将组织切碎 🦋 并用酶（如胶原酶）消化，释放细胞。
通过离心或密度梯度离 🕊 心分离干 🦟 细胞。
2. 培养 🐟 基配 🐧 方
无 🌷 血清培养基，含 🌴 有：
基础培养基 🐝 （如 🦆 DMEM/F12）
生 🍁 长 🦅 因 🪴 子：EGF、bFGF、RSpondin1
抗 🐋 生 🕸 素
其他 🐼 添 🐦 加剂：B27 补充剂补 🐺 充剂、N2
3. 培养环境 🐝
培养皿或 🌻 细胞培养瓶，涂有基底膜蛋白（如层粘连蛋白）
37°C，5% CO2 孵 🐒 箱
4. 培 🐞 养技 🐕 术
将分离的 🌲 干细胞接 🌸 种到培 🐵 养基中。
每 🐒 隔 23 天更换培养基 🍀 。
传代时，用，胰蛋白酶 🕸 消化细胞并重新接种 🌵 。
5. 鉴 🐯 定和 💐 表征 🦅
通过免疫标记（如 Lgr5、Bmi1）鉴定 🐈 肠道干细胞。
进行功能 🍀 分析，如 ☘ 集落形成和器 🦢 官类器官培养。
6. 应 🌵 用 🦟
培养的肠 🦄 道干细胞可用于：
研 🪴 究肠道发育和 🪴 疾病
肠道损 🦉 伤的 🐒 再生治疗
制造 🍀 肠道 🌷 组织工程结 🌺 构
2、肠道干细 🐛 胞培养过程中细胞中间泛黑
可 🐛 能的 🐺 成 🐬 因：
过高的细胞 ☘ 密度细胞密 🦈 度过高：会导致营养和氧气竞争，从而导致细胞死亡。
培养基耗尽培养 🌷 基：中的营养物质和生长因子耗尽会导致细胞死亡。
毒性物质积累：培养基中积累 🐒 的代谢废物和毒性物质会影响细胞健康。
pH 失衡：培 pH 养基值 🦊 的变化会影响细胞代 🐈 谢和增殖。
微生物污染：细菌或真菌污染会释放 🌷 毒素并杀死细胞。
机械损伤：传代或操作过程中过度搅拌 🐟 或刮擦会导致细胞死亡。
内源 🌵 性凋亡：肠 🐋 道干细胞在培养过程中可能会 🐅 发生内源性凋亡。
解 🌾 决方 ☘ 法：
优化细胞密度：定期 🐬 传代细胞以维持适宜的细胞密度。
定期更换培养基：每 🪴 23 天更换培养基，以补 🦍 充营养物质并去除废物。
避免毒性物质：使用高 🌵 品质培 🍁 养基和试剂，并避免使用含毒 🦍 性的抗生素或其他添加剂。
监测 pH 值：使 pH 用 pH 指 🐴 示剂或传感器监测培养基值，并根据需要进行调整。
控制污染：使用无菌技术，并定期检查污染迹象 🦆 。
小心操作：传代和 🐅 操作细胞时，轻，轻操作以避免机械损伤。
抑制凋 🐱 亡：添加抑制凋亡信号的因素，如抑制 🐛 ROCK 剂或 Bcl2 蛋白。
其 🐋 他注 🐧 意事 🐘 项：
确认培养基和补充剂与使用的 🐋 细胞类型相 🦟 匹配。
使用孵育器培养细胞，并 🐕 保持合适的温度、湿度和 CO2 浓度。
定期观察细胞形态 🦄 和生长情况，及时发现 🦋 问 🌷 题。
3、干细胞在肠粘膜修复中 🐒 的作用
干 🐬 细 🐦 胞在肠粘膜修复中的 🦆 作用
肠粘膜是一层复杂的细胞层，覆，盖在肠道的内表面负责吸收营养、分泌酶和免疫防御肠粘膜。不、断，受。到。物理化学和微生物损害因 🦢 此需要不断修复干细胞在肠粘膜修复中起着至关重要的 🐠 作用
肠干 🦄 细胞 🐝 的特点 🕷
自 🐺 我更新能力能：够分 🌷 裂并产生与自身相同的干细胞。
多能性能：够分化为肠道中的各种细胞类型，包 🐳 括上皮细胞、杯、状细胞肠腺隐窝细胞和潘氏细胞。
增殖速率高：在肠粘膜 🌷 损伤后，干细胞会迅速增殖以修复受损组织。
干 🐞 细胞在肠粘 🐬 膜修复中的 🐦 作用
干细胞参与 🐘 肠粘膜修复的过程包括：
创伤修复：当肠粘膜受到损伤时 🌷 ，干细胞会迁移到损伤部位并分化为上皮细 🐧 胞、杯，状细胞和肠腺隐窝细胞以恢复肠道的完整性。
增殖和分化：干细胞在肠腺隐窝肠（粘膜中的凹陷区域中增殖）并分化成上皮细胞 🐦 ，这（些）上皮细胞会向上迁移到肠绒毛肠粘膜中的突起区域的顶端。
细胞更新：肠绒毛上皮细胞不断脱落并被新形成的细胞取代。干细胞负责产生这些新的 🐞 细胞，确。保肠粘膜的持续更新
免疫防御：潘氏细胞是从干细 🐯 胞分化而来的一类肠道上皮细胞，它，们产 🌾 生抗菌物质 🦉 和调节免疫反应的细胞因子帮助保护肠道免受感染。
干细胞缺陷 🐡 对肠粘膜的影响
干细胞的缺陷或功能障碍会导致 🐞 肠粘膜修复受损，从而引发 💮 各种肠道疾 🕸 病。例如：
炎症性肠病 🐳 ：克罗恩病和溃疡性结肠炎是炎症性肠病，与肠，干细胞的缺陷有关导致肠粘膜无法正常修复。
结直肠癌肠 🍁 ：干细胞的突变和异常增殖可能是结直肠癌 🐝 发展的因素。
研究方向干细胞在肠粘膜修复中的作用是一个活跃的研究领域研究。人 🐬 员正在探 🌾 索：
干细胞的来源和 🌸 分化机制 🐶
干细胞 🕸 功能 🦍 障碍在 🍀 肠道疾病中的作用
开发干细胞 🪴 疗法来治疗肠道疾病的可 🌼 能性
干细胞在肠粘膜修复中起着 🕊 至关重要的作用。它们通过自我更新、增殖和分化来修复受损组织，维。持肠粘膜的。完整性和功能了解干细胞在肠道疾病中的作用对于开发新的治疗策略至关重要
4、肠道干细胞 🌼 如何培养出来
肠道干细 🌲 胞 🐟 培养 🐦 方法
材料：新鲜或冷 💮 冻的小 🐕 鼠结肠组织
含抗生素和抗真 🍁 菌剂的培养基，如DMEM/F12
B27补 🐝 充剂
N2补 💐 充 🦄 剂 🐡
Wnt3a生 🕷 长因 🦄 子 🐴
R喷 🐡 替尼（ROCK抑 🐯 制 🐎 剂）
培养皿 🐝 或培养瓶
步骤：1. 组织 🕷 分离 🐕 ：
在无菌条 🦁 件下，切 🌻 取 🐕 新鲜或冷冻的小鼠结肠组织。
用PBS洗涤组织以去除血 🐶 液和其他杂质。
使用手术刀或 💮 剪刀将组织切 🦆 成小 🐎 块。
2. 消 🌿 化和离心：
将组 🐈 织块放入含有胶原酶 🐒 和其他消化酶 🐝 的培养基中。
在37°C孵育1小时，每隔 🌷 20分钟搅拌一次。
用滤网过滤消 🌹 化物以去除未消化的 🐶 组织 🐘 。
将过滤物离 🐼 心以收集细胞。
3. 培 🐟 养：
将细 🦊 胞悬 🦈 浮在含Wnt3a生长因子 🐼 的培养基中。
加入R喷替尼以抑制Rho激酶 ROCK，这有助 🕷 于细胞存活。
将细 🕷 胞接种到 🕸 培养皿或培养瓶中。
在 🐺 37°C、5% CO2的条 🌳 件下孵育。
4. 克隆 🌾 形成 🐬 ：
培养710天，直至形成 🐱 克 🌳 隆 🐘 。
小心地用 🦟 移液枪将 🐵 克隆转 🐘 移到新的培养皿或培养瓶中。
5. 扩 🦟 增和 🦅 分离 🐬 ：
继续扩增 🌾 克隆 🦊 ，直到获得足够的 🦁 细胞。
使用 🍀 流式细胞仪或其他技术分离肠 🕷 道干细胞亚群。
培 🐺 养基配方：
DMEM/F12培养基，含1% B27补充剂补充剂，1% N2生，50 ng/mL Wnt3a长因 🦍 子和10 μM R喷替尼。
提示：确保使用 🌲 无菌技 🐛 术以防 🍁 止污染。
定期换液以维 🦅 持培养基的新鲜度。
使用 🐼 低 🐎 传代细胞以获得最佳结 🌻 果。
培 🦁 养条件可能根据小鼠品系或特定研究目的 🐺 而需 🐧 要优化。
