基因敲除 🌾 干细胞的制备（基于胚胎干细胞的基 🐱 因敲除小鼠制备原理与过程）
- 作者: 郭沁芒
- 来源: 投稿
- 2025-07-09
1、基因 🌸 敲除干细 🐟 胞的制备
基因敲除 🌷 干细胞的 🍁 制备
步骤：1. 设计和构 🐟 建指导 🐎 RNA (gRNA)
选择目标 🌸 基因的特定区域（通 🦋 常 🦆 为外显子）。
设计 gRNA，其中序 🦋 列互补于目标区域。
2. 将 gRNA 和 Cas9 引入 🪴 干细胞 🐧
使用病毒载 🌾 体或脂质体转染将 gRNA 和 Cas9 蛋白引入干细胞中 🐟 。
Cas9 将与 🐱 gRNA 结合，形成 CRISPRCas9 复合物。
3. 基因 🦉 敲 ☘ 除
CRISPRCas9 复合物 🐋 将结合 🦁 目 🐕 标 DNA 序列。
Cas9 将切割 DNA，导致 🐳 目标基因出现 🍀 双 ☘ 链断裂。
4. 非同源 🌻 末 🐅 端连接 (NHEJ) 和同源重组 (HR)
DNA 修复机制将修复双链断裂，要么通过非同源末端连接（导致基因敲除要么通过同源），重（组仅在 HR 供 DNA 体，存在的 🐶 情况下 🦉 导致基因插入）。
5. 筛选和 🌾 克 🪴 隆基因敲除干细胞
使用 PCR 或测序筛选 🐺 成功基因敲除的干细胞。
克隆具有所需基因敲除的单细胞以建立稳定的细胞系 🕸 。
6. 验证 🐼 基因 🐝 敲 🌸 除
使用 qPCR、Western 印迹或其他技术验证基因表达的敲除 💐 。
确保基因敲除不会 🐞 产生脱靶效应（对其他基 🐅 因造成非预期改 🌷 变）。
注 🐡 意事 🌾 项 🐶 ：
精确靶向和减少脱靶效应至关重 💮 要。
确保干细胞系稳定且具有所需的基因 🦅 型。
基 🐘 因敲除的表型可能因细胞类型和靶 🦋 向基因 ☘ 而异。
2、基于胚胎干细 💐 胞的 🍁 基因敲除小鼠制备原理与过程
基于胚 🐕 胎干 🦉 细胞的基因敲除小鼠 🍁 制备原理
基因敲除小鼠技术是通过胚胎干细 🌻 胞靶向性同源重 🐶 组的方法，将，外源基因插入或替换小鼠内源基因从而产生缺乏特定基因的模型小鼠。其原理如下：
胚胎干细胞胚胎 🦁 干细胞：是存在于早期胚胎中的多能干细胞，具有分化成各种组织的能力。
靶向性同源重组：将设计好的外源基因片段靶向（载体）引入胚胎干细胞，通，过同 🐧 源重组机制将外源基因片段插入或替换内源基因。
选择性标记：靶向载体通常带 🌳 有可以选择性的抗生素或荧光蛋白标 🐼 记基因以，筛选成功整 🐛 合靶向载体的胚胎干细胞克隆。
赤霉素筛选：成功整合 🐺 靶向载体的胚胎干细胞克 🕊 隆可以被赤霉素选择赤霉素可以，去除未整合的靶向载体。
嵌 🍀 合体小鼠：经过筛选和扩增的胚 🦢 胎干细胞被注射到受体胚胎中，发，生发育形成嵌合体小鼠。
生殖系传递：通过与野生型小鼠交配，将，嵌合体 🦋 小鼠中的整合靶向载体传递给后代产生携带基因敲除的纯合子小鼠。
基因敲除小鼠制备 🐕 过程
1. 设计靶向载体设 🌲 计靶向载体：包，括外源基因片段、选、择性标记同源臂（与内源基因同源的序列）和筛选酶切位点。
2. 转染胚胎干细 🪴 胞：将靶向载体转染胚胎干细胞，以进行靶向性 🐡 同 🐡 源重组。
3. 筛选和扩增胚胎干细胞克隆：使用选择性标记筛选成功整合靶向载体的胚胎干细胞克隆，并进行扩增 🌿 。
4. 赤霉素选择：使用赤霉 🌾 素选择去 💮 除未整合的靶向载体 🐅 。
5. 生成 🐈 嵌合体 🌻 小鼠：将筛选后的胚胎干细胞注射到受 🐺 体胚胎中，形成嵌合体小鼠。
6. 生殖系传 🐠 递：与野生 🦟 型小鼠交配，将嵌合体小鼠中的整合靶向载体传递给后代 🌼 。
7. 鉴定基因敲除小鼠：通过PCR、Southern杂交或其他分子方法鉴定携带基因敲除 🕷 的纯合子小鼠。
3、基因敲除为什么用胚胎干 🐬 细胞
使用胚胎干细胞 🦍 进行基 💮 因敲除有以下 🐬 原因：
易于操纵：胚胎干细胞是尚未分化且具有无限增 🕷 殖能力的干细胞。它们可以被轻松地转染或显微注射，从。而将外源基因导入或敲除特定基因
高效率：胚胎干细胞转 🌵 染或显微注射的效率很高。这。使得研究人员能够获得高比例的带有敲除或修饰基 🦄 因的细胞
克隆能力：胚 🌵 胎干细胞可 🐝 以 🦅 克隆产生具有相同遗传背景的多个细胞系。这。对于创建同基因型群体进行研究非常有帮助
多 🌷 能性：胚胎干细胞具有多能性，即它们可以分化为任何类型的细胞。这。使得研究人员能够使用基因敲除胚胎干细胞产生具有特定基因修饰的特定类型的细胞 🦁 或组织
产 🌴 生活物体：将敲除胚胎干细胞注入小鼠胚胎可以产生具有遗传性基因敲除的小鼠。这。允许研究基因敲除在整个生物体中的影响
与使用其他细胞类型相比使用，胚胎 🪴 干细胞进行基因敲除具有以下优势：
效率更高：胚胎 🐋 干细胞更容易被转染或显微注射效率更高 ☘ ，。
修饰特定 🌷 基 🌹 因更容易：胚胎干细胞尚未分化因，此特定基因的调控元件更易于靶向。
可 💮 生成同基因型 🐟 群体：胚胎干细胞可以克隆产生具有相同遗传背 🦢 景的群体，这对于研究非常有用。
可产生活物体 🦉 ：使用基因敲除胚胎干细胞产生的动物模型允许研究整个生物体中的基因功能。
由于这些优势，胚胎干细胞已成为基因敲除和研究基因功 🦄 能的有力工具。
4、基因敲除干细胞 🦅 的 🦍 制备工艺
基因敲除 🐋 干细胞的制备工艺 🦍
材料：胚 🌼 胎 🐟 干细 🕸 胞
CRISPR/Cas9系 🐋 统 🐅
向 🕸 导 🐎 RNA
供体DNA模 💮 板 🌿 （可 🐛 选）
细胞培养基 💐 和试剂 🦈
流程：1. 设 🌺 计向导 🪴 RNA：
选 🕷 择目 💮 标基 🕸 因序列。
设计向导RNA序列，使其靶向目标基因旁边的序列 🐡 PAM（NGG）。
2. 导 🪴 入CRISPR/Cas9系 🦟 统：
将编码Cas9和向导RNA的 🐵 载体转染或转导至胚胎干细胞。
或者，将 🐒 Cas9/向 🐴 导RNA复合物 🌺 直接电穿孔导入细胞。
3. 敲除目 🦉 标基因：
CRISPR/Cas9系统会识别和剪切PAM附近的DNA序列 🐼 。
这会导 🐠 致目标基因发生DNA双链断裂（DSB）。
4. 引入 🦋 供体DNA模板（可选）：
如果需要引入插 🐦 入或 🦄 替换，可提供供体DNA模板。
供体DNA包含靶序 🦊 列的编 🌺 辑版本或 🪴 新的序列。
细胞的同源重 🦊 组机制将使用供体DNA作为模板来修 🦄 复DSB。
5. 筛 🐕 选基因 🦉 敲除 🪴 克隆：
敲除后，使用PCR或 🌺 DNA测序 🦆 识别带有所需基因修饰的细胞克隆。
可以 🦢 通过敲入荧光报 🦢 告蛋白或使用抗性标记进行 🐼 阳性筛选。
6. 扩增和 🐼 分 🌲 化 🌳 ：
一旦确定了基因敲除克隆，就可以将其扩增并分化成 🌲 感兴趣的细胞 💐 类型。
优点：精确靶向和有 🐅 效基 🌹 因编辑 🌵
可用于研究基因功 🐵 能和 🐋 开发疾病模型
具有潜 🦍 在的 🐯 治疗 🌷 应用
注意 🐈 事项：
脱靶效应可能是 🐵 问题，需要仔 🐺 细设 ☘ 计向导RNA。
基因敲除可能导致细胞死亡或 🕸 缺乏功能因，此需 🍀 要筛选 🕊 健康克隆。
伦理问题与修饰胚胎干细 🐡 胞 🐧 的使用有关。
