原代大鼠干细胞分离培养（原代大鼠干细胞分离培养实验报告 🐶 ）
- 作者: 马鹿瑶
- 来源: 投稿
- 2025-05-22
1、原代大鼠干细胞分离培养 🌷
原 🐝 代大鼠干细胞分离培养
材料雄 🪴 性Sprague Dawley大鼠（68 周 🪴 龄 🐎 ）
无菌 🐕 仪器和培养 🐦 皿 🦍
Dulbecco's改良鹰氏培 🐧 养 🦢 基（DMEM）
牛 🕷 血清 🐧 白 🌳 蛋白（BSA）
胰 🦁 蛋 ☘ 白酶 🕷
胶 🐒 原酶 IV
转化生 🕊 长因 🐘 子 β (TGFβ)
白 🐴 血病抑 🦅 制因子 🦊 (LIF)
血 🦊 小 💮 板衍 🐛 生生长因子 (PDGF)
方法1. 大鼠处死和睾丸摘 🐕 取
对 🦋 大鼠实施二氧化 🐡 碳安乐死。
切开阴 🦅 囊皮肤，暴露睾 🐛 丸。
小心取 🐺 出睾丸并 🌼 置于无菌培 🕷 养皿中。
2. 睾 🦅 丸胶 🦆 原酶消 🦆 化
用PBS清洗睾 🪴 丸，去除多余的血液和组织 🐡 。
将睾 🐋 丸转移到含 🐳 0.5 mg/mL 胶原酶 IV 的 🐘 DMEM 培养基中。
在 37 °C 下 🐺 孵育 1 小时，同 🐎 时每 15 分钟 🦄 吹打一次细胞。
3. 胰蛋白酶 🌷 消化 🌳
用PBS清洗 🦅 睾丸细胞悬液，去除胶原酶残留。
将细胞悬液转移到 🌳 含 0.25% 胰蛋白酶 🦍 的 DMEM 培养 🦊 基中。
在 37 °C 下孵育 30 分钟，同时每分 🐶 钟 10 吹 🍀 打 🐞 一次细胞。
4. 终 🌻 止 🐧 消化和过 🕷 滤
用 🌹 含 10% 牛血清白蛋白的 DMEM 培养基终止消化。
用 70 μm 细胞 🍀 滤 🌷 网过滤细胞 🦁 悬液。
5. 细胞 🐟 富 🐒 集
将 🌴 细 🕸 胞悬液离心 5 分钟，1000 rpm。
去 🐞 除上清液 🦄 ，重悬细胞于含 10% 牛血清白蛋 🍀 白的 DMEM 培养基中。
在 37 °C、5% CO2 孵 🐎 育器中 🌳 过夜。
6. 干 🦁 细 🐘 胞培养
次日，去 🌴 除非 🐯 贴 🦢 壁细胞。
将贴壁细胞重悬于含 TGFβ、LIF 和 PDGF 的无 🦅 血清 DMEM 培养基中。
在 🐴 37 °C、5% CO2 孵育器中培养 🐒 细胞。
每 23 天更换培养基 🐳 。
细胞鉴定免疫细 🐞 胞化学：使用 SSEA1、Oct4 和 Sox2 等标记进 🐦 行免疫细胞化学 🦢 染色，确认干细胞特性。
分化潜力 🐼 ：将细胞诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞，以评估多能性。
2、原代大鼠干细胞分离培养 🍁 实验报告
原代大鼠干细胞分离培养 🐱 实验 🍁 报告
一、目的分离和培养原代大鼠干 🐴 细胞 🐺 ，为后续研究其特性和功能提供实验材料 🦉 。
二、材 🌲 料和方 🌿 法 🌹
2.1 材 🐈 料 🌾
68 周 ☘ 龄雄性 🐛 SpragueDawley 大 🕊 鼠
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
胎 🐬 牛 🕊 血清 🐳 (FBS)
胰 🐠 蛋 🐛 白 🐛 酶
青霉素/链霉 🦈 素
培养 🐟 板和培 🍀 养瓶
细胞计数 🦟 器
2.2 方 ☘ 法 🕸
2.2.1 组织 🐠 获 🦆 取
将大鼠处 🐞 死，分离 🐛 出股骨和胫骨。
将骨头转移到无菌培 🦊 养皿中，切，开两 🐳 端冲 🐈 洗出骨髓。
2.2.2 细胞消 ☘ 化 🦄
在 37°C 下将骨髓悬浮液消化 30 分 🐘 钟，每悬浮液 10 ml 加入 1 ml 胰蛋白酶溶 🐒 液。
离心 🐬 去除胰蛋白酶，用含 10% FBS 的 DMEM 重悬细 🐶 胞。
2.2.3 单 🌻 细胞悬浮 🌷 液的 🍁 制备
通过 70 μm 滤 🐒 网过滤细胞悬浮液。
离心去除滤 🐴 液 🐘 ，用含 10% FBS 的 DMEM 重悬细胞。
2.2.4 细 🌳 胞 🐦 计数 🐛
使用细胞计数器 🐡 计 🦉 数细胞浓度。
2.2.5 细胞培 🐧 养
将单细胞悬浮液接种到预先涂有 0.1% 明胶的培养板中（约 106 个细胞 🦍 /ml）。
在 37°C、5% CO2 的孵 🐦 育器中孵育细胞 🦟 。
每 34 天 🐛 更换培养基。
三、结果3.1 细胞形态 🐈
从骨髓中分离出的 🐶 细胞呈 🐟 多边形或圆形，大小不一。
随着培养时间的 🪴 延长，细，胞逐渐贴壁生长形成紧密贴合的单层。
3.2 细 🐠 胞增 🐱 殖 🐼
细胞在培养基中快速增殖，对数生长期 🌴 持续约 57 天。
培养 7 天后，细胞数量达到饱和 🦢 状态 🌴 。
3.3 细胞 🐺 免疫 🐳 表型
使用流式细胞术分 💮 析分，离出 🌿 的细胞表达 CD29、CD44、CD90 和 CD105 等，干细胞标记不表 🪴 达和等 CD34、CD45 血细胞标记 CD11b 。
四、讨论本实验成功分离和培养了原代大鼠干细胞。这些细胞具有干细胞的典型形态、增。殖能力和免 🐒 疫表型它们可用 🐴 于后续研究，例 🐳 、如干细胞分。化自我更新和治疗潜力
五、结论我们建立了一种可靠的方法来分离和培养原代大鼠干细胞。这。些细胞为研究干细胞生物学和开发干细胞疗法提 🕊 供了宝贵的材料
3、原代大鼠干 🦟 细胞分离 🐈 培养方法
材料48 或 96 孔 🦍 培养 🌳 板
DMEM/F12 培养 🐳 基，含 10% FBS
胰 🐱 蛋白酶溶液 (0.25%)
75 厘 🐝 米2 培养瓶
灭 🕸 菌 🐈 PBS
冻存 💐 液 (10% DMSO + 90% FBS)
液氮罐步骤
1. 解 🦁 剖取材：
在无菌 🍀 条件下，对 13 日龄的健康大鼠进行解剖。
取出脑 🌹 、心脏或肝脏等感兴趣的组织。
2. 组织消化 🦁 ：
将组织 🐴 切 🐛 成小块，用 🐳 胰蛋白酶溶液消化 3045 分钟。
消 🌳 化过程中，定 🐟 期吹打或振荡组织 🦢 。
3. 终 🌾 止消 🌲 化 💮 ：
加入等体积的含的 🌴 FBS 培 DMEM/F12 养基以终止消化。
将细胞悬液通过 🐈 细胞 70 μm 滤网过滤。
4. 去 🐎 除 🐶 红 🐺 细胞：
在细胞悬液 🌾 中 🌹 加入 RBC 裂解液，并 incubate 5 分钟。
离心（300g，5 分钟）并弃 💮 去上 🐯 清 🐱 液。
用 🌼 含 FBS 的培养基重悬 🐴 细 💐 胞。
5. 接 🐛 种 🐦 ：
将细胞悬 🐝 液 🌾 接种到预铺好 🐛 的 48 或 96 孔培养板中。
每 🌺 孔接种 15×10^5 个 🐎 细胞。
在含 5% CO2 的 🌲 37°C 培养箱 🍀 中培养 24 小时。
6. 更换 🐕 培 🐺 养基 🕊 ：
24 小时后小 🦟 ，心去除上清 🌺 液并更换为新鲜的培养基。
以后每 23 天 💐 更换 🐱 一次 💐 培养基。
7. 培养和监测 🐡 ：
定 🌸 期观察细胞生 🌷 长情况 🐬 。
细胞融合形成克隆时，可以 🐺 将其转移到 75 cm2 培养瓶中继续扩增。
8. 冻 ☘ 存 🐅 ：
当细胞达到 7080% 融合度时 🐎 ，可以进行冻 🌵 存。
收集细胞并离心（300g，5 分钟 🐒 ）。
弃去上清液，用 🐋 冻 🌲 存液重悬细胞 🐧 。
将细胞 🐱 分装到冻存管中 🐳 ，缓 🦅 慢冷冻至 80°C。
将冻存管转 🌿 移到液氮罐中进行长 🐳 期保存 🐵 。
提示使用 🐵 新鲜 🕊 健康的 🌴 组织。
在无菌条件下进行 🐺 所有 ☘ 操作。
培养基中补充抗 🦍 生素以防 ☘ 止细菌污染 🦅 。
根据组织类型调 🌸 整消化时间。
监测 🐱 细 🐅 胞生长情况并及时更换培养基以支持细 🦈 胞生长。
冻 🦆 存细胞时，缓慢 🌿 冷冻可减少细胞损伤。
4、原代大鼠干细 🌹 胞分离培养原理
原代大鼠干细 🐦 胞分 🐝 离培养原理 🌲
原代大鼠 🍁 干细胞分离培养过程涉及以下基本原理：
组织分离 🌾 :
将大鼠组织收集并切 🐈 成小 🐅 块。
使用酶促消化 🐒 （如 🪴 胰蛋白酶）分 🐋 离细胞。
培养基 🪴 筛选 🐺 :
将分离出的细胞悬液接种在含有特 🦉 定生长因 🐯 子的培养基中。
干细胞对特定生长因子（如 EGF 和 bFGF）有增殖 🐦 和自我更新的反应。
黏附 🐳 和 🪴 增殖 🦍 :
干细胞 🌻 会附着在培养皿或培养瓶的表面上。
它们在富含生长因子的培养基 🌼 中 🌲 增 🌷 殖形成细胞簇。
细胞表面标志物 🐦 筛 🦈 选:
使用免疫荧光或流式细胞术分析细胞表面标志物（如 🌴 CD29、CD44 和 🐛 Sca1）来鉴定干细胞 🌴 。
干细胞表达独特的细 🐈 胞表面标志物组合。
分化诱 💐 导 🌷 :
培养基中添加特定的诱导剂可诱导干细胞分化为特定细胞类型（如 🐟 神经元、成骨细胞或软骨细胞 🐒 ）。
诱导 🐱 剂模拟了体内环 🕷 境中的信号。
分离培养过程 🌳 步骤：
1. 组 🐟 织 🐱 分离 🐠 :
将大鼠处死并收 🦅 集感兴趣的组织。
用无菌手术器械切 🌳 成小块。
2. 酶促消 🌷 化:
将组织块放入含有 🐡 胰蛋白酶或胶 🦊 原酶的消化液中。
孵育 🐺 一 💮 段时间使其消化成单细胞悬液。
3. 培养 🕷 基筛选:
将细胞悬液离心并 resuspend 在含有 EGF、bFGF 和其他 ☘ 生长因子的培养基中。
接种细胞到培 🐕 养皿或培 🦟 养瓶中。
4. 黏 🦋 附和增 🦍 殖:
干细胞会附着在培 🌸 养表面上 🦁 。
更换培养基 🦋 去除未附着的细胞和碎片 🍀 。
干细胞 🐠 在培养基中增殖形成细胞簇 🦆 。
5. 细胞表 🕷 面标 🐟 志物筛 🐡 选:
使 🌺 用免疫荧光或流式细胞术检测细胞表面标志物 🦉 。
选择表达特定标志物组合的细 🪴 胞。
6. 分化诱导 🐼 :
根据所需 🦄 的细胞类型添加特定的 🌻 诱导剂 🦆 到培养基中。
将细胞诱 🌾 导分化 🐴 一段时间。
注 🪴 意 🌴 事项 💐 :
维 🐱 持无菌条件 🦄 至关重 🐶 要，以防止污染。
监测细胞 🌳 增殖和形态，以 🌳 确保健康生长。
使用优化协议和培养基成 🌷 分，以最大 💐 化干细胞的增殖 🐅 和分化效率。
