大鼠肝脏干细胞 🦅 提取（大鼠 🐞 肝脏总rna提取虚拟实验）
- 作者: 张南湘
- 来源: 投稿
- 2025-10-13
1、大 🦁 鼠肝脏干细胞提取
大鼠肝脏干 🐞 细胞提取 🦋
材料大鼠（雄 🐯 性，812 周龄）
无菌手术器 🐧 具 🦟
无菌 💮 手术 🍁 室 🦢
肝脏灌流 ☘ 液 🐈
胶原酶溶 🐞 液
密 🦈 度 🌲 梯度离心 🕸 液
培养基培 🌷 养皿和培养 🍀 瓶
程序1. 动物 🦊 准 🍀 备：
大鼠用二 🌷 氧化碳麻醉 💐 。
腹腔 🌳 切开，暴 🦉 露肝脏。
2. 肝脏灌流 🐅 ：
用 🐕 肝脏灌流液通 🐅 过门静脉灌流 ☘ 肝脏，去除血液和淋巴液。
3. 肝 🐠 脏 🐶 切除：
切除肝 🕷 脏并 🐵 立即放入无菌培养皿 🐈 中。
4. 肝细胞 ☘ 悬液 🐴 制备 🍀 ：
用胶原酶 🍁 溶液消化肝脏组织，释放出肝细胞悬液。
5. 密 🐧 度梯度 🐴 离 🌹 心：
将 🌿 肝细胞悬液离心在密度梯度离心液中，分离出肝脏干 🍀 细胞。
6. 肝脏 🌻 干 🦊 细胞 🐠 收集：
收集密度 🦋 梯度离心后肝脏干细胞层。
7. 培 🐒 养：
将收集到的肝脏干 🐳 细胞悬浮在培养基中 🌷 ，并在细胞培养箱中培养。
培养基常用的培 🐕 养基包 🦆 括：
Williams' E 培 🪴 养 🐶 基 🌷
Dulbecco's 改良鹰 🌷 氏 🐋 培 🐅 养基 (DMEM)
DMEM/F12 培 🐠 养基 🌳
培养基通 🌳 常补充 🐬 有：
1020% 胎牛 🌸 血 🐛 清 🦉
生 🐴 长 🦅 因子和 💮 激素（如 EGF、HGF）
抗 🐦 生素和 🕊 抗真菌 🌳 剂
注意点所 🐛 有程序应在无 🌾 菌条件下进行。
使用新鲜的大鼠至关重要，因为陈旧的 🌼 肝脏会影响肝 🍁 脏干细胞的 🦉 产量和活性。
胶原酶 🐕 溶液 🐯 的浓度和 🐞 消化时间应根据具体实验条件进行优化。
通过密度梯度离心分离肝脏干 🐯 细胞时离心，速度和时间应 🐱 根据密度梯度离心 🌺 液的类型进行调整。
培养过程应定期监测，必要时更换 🦁 培养基。
2、大鼠肝脏总rna提取 🕷 虚拟实验
大鼠肝 🐟 脏总 RNA 提取 🐦 虚拟实验
目标：掌握大鼠 🐯 肝脏总 RNA 提取的原理和步骤。
材料 🐠 和试剂：
大鼠肝脏 🌿 组织 🐋
三 🐝 唑 🐱 试剂 🍁
氯仿异丙醇
75% 乙 🌵 醇 🍁
无 🦊 水乙 🦄 醇 🌹
DEPC 水 🦋
步骤：1. 组织匀 🐅 浆 🦆
取适 🐈 量大鼠肝脏组织，置于三唑试剂中。
使用匀 🌷 浆器将组织匀 🐒 浆 🦊 。
2. 离 🕷 心 🐱
将匀 🦈 浆物在 🌿 12,000 x g 下离心 15 分 🍀 钟，4°C。
上层为 🐼 清澈的上清液，含有 🦆 RNA。
3. 氯 🍁 仿 💮 萃 🌲 取
向上清液中加入等体积的 🦁 氯仿。
剧烈振荡 15 秒 🐎 ，室温。
离心 🦄 12,000 x g，15 分钟 🍁 ，4°C。
上层 🦍 为含有 RNA 的 🐳 水相 🍀 。
4. 异 🌴 丙醇沉淀 🐟
向水相中加入 0.5 倍体积的 🐟 异丙醇。
涡旋混合，在 20°C 下 🐱 放置 1 小 🐞 时 🐛 或过夜。
离心 🐞 12,000 x g，10 分 🌳 钟，4°C。
沉 🦊 淀 🌿 为 🐳 RNA。
5. 洗 🍁 涤 🦆
用 75% 乙醇 🌴 洗涤沉淀 🐡 两次，每次离心 🦅 7,500 x g，5 分钟，4°C。
用无水乙 🐋 醇洗涤沉 🐝 淀一次，离心 7,500 x g，5 分钟，4°C。
6. 溶 🌵 解 🐱 RNA
将沉 🦢 淀用 DEPC 水溶 🍀 解。
涡 🐵 旋混合，室温 🕊 放置 15 分钟。
结果：大 🐵 鼠肝脏总 RNA 成功提取 🐦 。
原理：三唑试剂是一种裂解剂，可 🌴 溶解细胞成分并释放 RNA。氯仿萃取可分离 RNA、DNA 和。蛋 RNA。白质异丙醇沉淀可沉淀乙醇 🌿 洗涤可去除残留的盐和试剂。DEPC 水可灭活 RNase，保护 RNA 免。受降 🕊 解
3、大鼠脂肪干细 🐞 胞的提取方法
大 🕷 鼠脂肪干 🐡 细胞的 🐛 提取方法
材料：大鼠
生理盐 🦄 水 🐘
胰蛋 🌵 白 🐺 酶 🐺
胶原 🐯 酶 II
纤 ☘ 维蛋白原溶液
培养基 🍁 （含 🌺 10% FBS）
培养皿离心机
显微镜
步骤：
1. 获 🦍 取脂 💐 肪组织：
对大 🦁 鼠 🐯 实 🐟 施麻醉。
在腹部 🌷 长切口，取出腹腔脂肪。
将脂肪 💐 组织切成 🌸 小块，置于生理盐水中。
2. 酶 🦄 消化：
制备 🐯 胰蛋 🐟 白酶和胶原酶 II 混合液 🐈 （每 100 ml 生理盐水中，加入胰蛋白酶和胶原酶 0.05 g 0.3 g II）。
将脂肪组 🦆 织与酶混合液按 1:2 的体积比混合。
在 🦈 37°C 搅 🕸 拌消 🌷 化 30 分钟。
3. 过滤和 🌷 离 🌻 心 🌸 ：
将消化后的细胞混合物过滤通 🌳 过滤 100 μm 器，以去除 🐒 组织碎 🐘 片。
将 🐦 过滤液 🪴 离心 🌻 10 分钟，1000 x g。
4. 浮选 🐞 ：
小心地吸 🕸 除上清液，避免触及细胞沉淀。
向细胞沉淀中加入 20% 纤维蛋白原 🐈 溶液，使其 🐅 完 🐎 全覆盖细胞。
在 37°C 孵 🌾 育 30 分钟 🍁 。
5. 收集上 🐳 层细胞：
离心 10 分钟 ☘ ，1000 x g。
小心吸 🐱 取并收集浮在上层纤维蛋白凝块上的细胞，避免 🦋 触及下层细 🐕 胞。
6. 洗涤和培养 🦈 ：
用培养基洗涤 🦅 收集的细胞 3 次，每 🐘 次 1000 x g 离心 5 分 🦄 钟。
将细 🦊 胞重悬于培养基 🌴 中，接种于 🍁 培养皿中。
在 🌹 37°C、5% CO2 条 🌼 件下培养 🐡 。
提示：为提高干细胞的 🐟 产率，可以使用新鲜的脂肪组织。
胰蛋白酶和胶原酶 II 的消 🌻 化时间和浓度需要根据脂肪组织的具体情况进行优化。
浮选步骤可以 🐧 有效富集脂肪干细胞，但，需小心操作避免细胞损伤。
培养基的选择 🦅 应根据特定应用 🕊 进 🦟 行调整。
4、大鼠 🐺 骨髓间充质干细胞提取
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）提取 🐞
材料：大鼠
生理盐水 💐
胎 🦉 牛血 🐞 清（FBS）
Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）
青 🐎 链霉 🌵 素链霉素 🪴 /
胰酶培 🐵 养皿和培养 ☘ 瓶
移液枪 🦋 和 🐟 吸 🦈 头
细胞 🐼 培养 🦢 箱 🐒
细胞 🦁 刮刀
步骤：1. 骨髓收 🐦 集 🐛
将大鼠处死 🌷 并无菌条件下取出四肢骨（股骨和胫骨）。
用生理盐水 🌻 冲洗骨髓腔，收集到培养皿 🐛 中。
2. 红细胞 🐼 裂 🐦 解 🐝
加入 🌳 810 mL 170 mM 氨水 🐡 溶液，孵育 5 分钟。
离心（300 x g，5 分钟 🐒 ）去 🐯 除红细胞碎片 🐺 。
3. 胰酶 🦅 消 🐅 化 🌻
加入 5 mL 0.1% 胰酶溶液 🐠 ，37°C 孵育 30 分钟。
轻轻 🐟 吹 🦋 打组织以释放细胞。
4. 过滤 🐱 和 🌼 离心
将细胞悬液过滤过 🌾 滤 🌹 100 μm 网 🦈 ，去除组织碎片。
离 🦋 心 🦉 （300 x g，5 分 🌷 钟）。
5. 种植 🦍 和培养 🌸
弃去上清 🐠 液 🕷 ，加入 10 mL 含 10% FBS 的 DMEM。
将细胞悬液接种到 🐟 培养皿中 🐞 培养，37°C 箱中 🐡 培养。
每 🐕 23 天 🪴 更换培养 🐈 液。
6. 净 🐘 化 🐴
培养 🕷 710 天后，贴壁骨髓 🐛 间充质干细胞将形 🌴 成分层。
用细胞刮刀收 🍁 集贴壁细胞。
用含有 10% FBS 的 DMEM 几 🕷 次清洗 🦆 细胞。
7. 鉴 🦈 定 ☘
通过免疫表型（CD29、CD44、CD90 等）和（多、向 🐵 ）分化潜能成骨成软骨和成脂肪鉴定 BMSCs。
注 🌷 意事 💮 项 🌾 ：
保持无菌条件 🪴 。
轻柔处理细胞，避免损伤 🐳 。
定期监测细胞生长 🐕 情况，并根据需要 🌹 进行传代。
使 🐬 用高品质的培养基和 🌳 试剂。
