小鼠毛囊干细胞提取（骨片法提取小鼠间充质干细胞）
- 作者: 刘穆心
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、小鼠毛囊干细胞提取
小鼠毛囊干细胞提取
材料：小鼠
消毒棉签
无菌手术剪刀
无菌镊子
无菌培养皿
含抗生素的培养基
毛囊提取试剂盒
程序：1. 麻醉小鼠：使用异氟烷或戊巴比妥等标准麻醉剂麻醉小鼠。
2. 消毒手术部位：用消毒棉签擦拭小鼠背部，清除毛囊周围的碎屑和细菌。
3. 提取毛囊：
用手术剪刀剪去目标毛囊周围的毛发。
用无菌镊子轻轻抓住毛囊。
沿着毛囊周围的皮下组织切割，释放毛囊。
4. 转移毛囊：
将毛囊转移到无菌培养皿中。
在培养基中洗涤毛囊以去除任何杂质。
使用毛囊提取试剂盒进一步纯化毛囊。
5. 培养：
将提取的毛囊转移到含抗生素的培养基中。
将培养皿置于 37°C、5% CO2 的培养箱中培养。
定期更换培养基。
注意事项：
在严格的无菌条件下进行手术以防止污染。
使用锋利的仪器，以干净利落地提取毛囊。
小心操作，避免损坏毛囊或周围组织。
遵守所有动物护理和使用准则。
2、骨片法提取小鼠间充质干细胞
骨片法提取小鼠间充质干细胞
材料48 周龄的 C57BL/6 小鼠
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基（DMEM）
胎牛血清（FBS）
青霉素/链霉素溶液
胶原酶 II
aMEM（含 20% FBS）
细胞计数仪
培养板分离管
方法
1. 小鼠安乐死和无菌解剖：根据机构指南安乐死小鼠，并无菌解剖。取出股骨和胫骨。
2. 骨髓取出：用无菌剪刀剪开骨头两端，然后用 PBS 冲洗出骨髓。
3. 骨片制备：将股骨和胫骨切成碎片，大小约为 1 至 2 毫米。
4. 酶消化：将骨片转移到装有 10 毫升 DMEM 含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素溶液的分离管中。加入 1 毫克/毫升胶原酶 II 和 0.2 毫克/毫升透明质酸酶。37°C 孵育 1 小时，每 15 分钟涡旋一次。
5. 细胞过滤和离心：将消化后的细胞悬液过滤通过 70 微米细胞过滤器。以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 细胞重悬和培养：将沉淀细胞重悬在 aMEM 含 20% FBS 中。接种细胞至培养板中。37°C、5% CO2 孵育。
7. 培养基更换：每 23 天更换培养基。
8. 细胞扩增和分离：培养 710 天后，细胞将增殖并形成集落。可以用胰酶处理并传代细胞。
鉴定提取的间充质干细胞可以通过以下标记进行鉴定：
CD44+
CD90+
CD105+
CD34
CD45
3、小鼠骨髓间充质干细胞提取
小鼠骨髓间充质干细胞提取
材料：小鼠（48 周龄）
无菌手术工具（剪刀、镊子、移液枪、离心机等）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）
胎牛血清（FBS）
抗生素（青霉素和链霉素）
胰蛋白酶溶液
骨胶原酶溶液
红细胞裂解缓冲液
培养皿细胞培养基（如 DMEM + 10% FBS + 抗生素）
步骤：1. 移除骨髓
对小鼠实施无菌麻醉。
用剪刀和镊子在两侧的股骨两端切开皮肤。
暴露股骨骨干，并用剪刀小心剪开两端。
用无菌移液枪冲洗骨髓腔，收集在培养皿中。
2. 消化骨髓
在收集的骨髓中加入胰蛋白酶溶液，用移液枪混合。
将细胞悬液孵育 37°C 30 分钟，偶尔振摇以避免细胞沉淀。
用骨胶原酶溶液终止消化过程，孵育 37°C 15 分钟。
3. 过滤和离心
将细胞悬液通过 70μm 细胞滤器进行过滤，除去未消化的骨碎片和其他杂质。
将细胞悬液在 1200 rpm 下离心 10 分钟。
4. 红细胞裂解
移去上清液，重悬细胞于红细胞裂解缓冲液中。
孵育 5 分钟，然后在 1200 rpm 下离心 5 分钟。
5. 洗涤和重悬
移去上清液，用培养基洗涤细胞两次。
每次洗涤后在 1200 rpm 下离心 5 分钟。
将细胞重悬于培养基中。
6. 培养
将细胞接种到培养皿中，密度为 12 x 10^6 个细胞/mL。
在 37°C、5% CO2 培养箱中培养细胞。
每 34 天更换培养基。
鉴定：流式细胞术分析：表面标记物，如 CD29、CD90、CD105
多向分化潜能：向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化
克隆形成单位纤维母细胞（CFUF）试验：评估克隆形成能力
4、小鼠脂肪间充质干细胞提取
小鼠脂肪间充质干细胞提取
材料：SPF小鼠
消毒器材（镊子、剪刀、培养皿、移液枪）
DMEM（含10% FBS和1%抗生素）
胶原酶Ⅰ
红细胞裂解液
PBS培养皿
培养液（DMEM，含10% FBS和1%抗生素）
步骤：1. 麻醉小鼠：用异氟醚麻醉小鼠。
2. 取出脂肪组织：消毒手术区域，沿腹中线切开皮肤，取出腹腔脂肪组织。
3. 细碎脂肪组织：将脂肪组织剪成小块，放入培养皿中。
4. 消化酶消化：加入含胶原酶Ⅰ的DMEM，按比例1:10，在37℃摇床上消化1小时。
5. 消化液过滤：用70微米滤网过滤消化液，除去碎屑和细胞碎片。
6. 离心：将滤液在1200rpm离心10分钟，收集沉淀。
7. 红细胞裂解：加入红细胞裂解液，在室温孵育5分钟，裂解红细胞。
8. 第二次离心：在1200rpm离心5分钟，收集沉淀，即脂肪间充质干细胞（ASCs）。
9. 重悬细胞：用培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1x10^6个/mL。
10. 接种细胞：将细胞接种到培养皿中，在37℃、5% CO2培养箱中培养。
注意：整个操作过程中遵守无菌技术。
消化时间和酶浓度可能因脂肪组织来源和小鼠品种而异，需要优化。
分离出的ASCs需要进行鉴定，以确认其多向分化潜能和表面标志物表达。
