分离小鼠脂肪干细胞（小鼠肝细胞分离获得完整细胞需要注意哪些问题）
- 作者: 朱予希
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、分离小鼠脂肪干细胞
材料：小鼠脂肪组织
磷酸缓冲盐溶液 (PBS)
胶原酶 IV (5 mg/mL)
胰蛋白酶 (1 mg/mL)
DNase I (100 U/mL)
胎牛血清 (FBS)
培养基 (如 αMEM、DMEM)
步骤：1. 脂肪组织采集：从小鼠腹部或背部小心取出脂肪组织，将其放置在无菌培养皿中。
2. 胶原酶消化：用 PBS 冲洗脂肪组织以去除血液或其他杂质。将胶原酶 IV 和 DNase I 制备成溶液，加入脂肪组织中达到 1 mg/mL 的浓度。在 37°C 水浴中消化 3060 分钟，每隔 15 分钟摇晃一次。
3. 胰蛋白酶消化：消化后，加入胰蛋白酶溶液，达到 0.5 mg/mL 的浓度。继续消化 1530 分钟，摇晃次数同上。
4. 终止消化：消化完成后，加入含 10% FBS 的培养基终止消化。
5. 过滤：将细胞悬液通过 70 μm 细胞滤器过滤，去除任何未消化的脂肪或杂质。
6. 离心和收集：将细胞悬液 4°C、1200 rpm 离心 10 分钟。小心吸取上清液，收集细胞沉淀。
7. 重悬和培养：将细胞沉淀重悬在含 10% FBS 的培养基中。将细胞接种到培养板上或培养瓶中，在 37°C、5% CO2 incubate 中培养。
提示：脂肪组织的大小和消化时间可能因小鼠品种和脂肪组织类型而异。
可以使用免疫细胞化学或流式细胞术对分离出的干细胞进行表征。
分离出的脂肪干细胞可以用于各种研究和治疗目的。
2、小鼠肝细胞分离获得完整细胞需要注意哪些问题
小鼠肝细胞分离获得完整细胞需注意的问题：
1. 选择合适的动物和分离方法：
选择健康的、年轻（48周龄）的雌性小鼠。
使用经过验证的分离方法，例如胶原酶消化或percoll梯度离心。
2. 肝脏灌注和分离：
使用无钙缓冲液灌注肝脏，清除红细胞。
用胶原酶消化肝组织，将细胞从组织中释放出来。
3. 洗涤和离心：
用缓冲液洗涤细胞悬液以去除残留的组织碎片和胶原酶。
使用低速离心（50100x g）收集完整的肝细胞。
4. 细胞活力评估：
分离后立即评估细胞活力，例如通过排除色素体的试验（例如台盼蓝）或测量ATP水平。
5. 培养条件：
使用含生长因子的培养基培养肝细胞，例如威廉姆斯E培养基或德默索培养基。
提供合适的细胞培养条件，包括合适的温度（37℃）、湿度、CO2浓度和营养成分。
6. 避免细胞应激：
避免剧烈离心和频繁洗涤，这可能会损伤细胞。
使用新鲜的缓冲液和培养基，避免pH值或渗透压的波动。
7. 污染预防：
所有仪器和材料应灭菌。
培养肝细胞时使用抗生素或抗真菌剂以防止污染。
8. 其他考虑因素：
分离步骤的时间应尽可能短，以避免细胞损伤。
分离得到的完整细胞的数量和质量可能因小鼠菌株、年龄、健康状况和分离方法而异。
培养肝细胞需要监测细胞生长、活力和功能，以确保最佳性能。
3、小鼠肝细胞的分离技术和影响因素探讨
小鼠肝细胞的分离技术
1. 两步胶原酶消化法
最常用的方法，包括：
第一步：低浓度胶原酶消化肝组织，释放上皮细胞和肝细胞。
第二步：高浓度胶原酶消化，释放纯肝细胞。
2. 肝灌流法
将含胶原酶的灌流液通过肝脏门静脉灌注，消化肝细胞并从下腔静脉收集。
3. 肝门静脉离断法
先离断肝门静脉，然后注入含胶原酶的缓冲液，使肝细胞悬浮在肝脏内，最后通过肝门静脉冲洗收集。
4. 差速离心法
利用离心力的差异分离不同密度的细胞，包括：
连续密度梯度离心
单步离心（Percoll 密度梯度）
影响因素1. 胶原酶类型和浓度
胶原酶类型：常用 Collagenase IV、Collagenase V 和 Pronase
浓度：取决于肝组织的硬度和胶原酶的活性
2. 孵育时间和温度
孵育时间：通常为 1030 分钟
温度：37°C 恒温
3. 悬浮液成分
蛋白酶抑制剂（如 Aprotinin、Leupeptin）：防止细胞损伤
钙离子：促进细胞粘附
保护缓冲液（如 HBSS、DMEM）：维持细胞活力
4. 组织来源和动物年龄
不同组织和不同年龄动物的肝细胞特性和胶原酶敏感性不同
5. 离心条件
离心速度和时间：影响细胞分离的纯度和产量
优化方法确定最佳的胶原酶类型、浓度和孵育条件。
优化悬浮液成分和离心条件以提高细胞活力和纯度。
考虑组织来源和动物年龄的差异。
使用新鲜组织进行分离，以减少细胞损伤。
4、大鼠脂肪间充质干细胞提取
大鼠脂肪间充质干细胞提取
材料：成年雄性或雌性大鼠
无菌器械和器具
无菌磷酸盐缓冲液 (PBS)
无菌胶原酶溶液 (0.25% 胶原酶 I 和 0.05% 透明质酸酶)
无血清培养基（如 Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM] 或 α最低必需培养基 [αMEM]）
离心机过滤器（40100 μm）
步骤：1. 麻醉和安乐死大鼠：使用合适的麻醉方法（如异氟烷或氯胺酮）麻醉大鼠，然后进行安乐死。
2. 提取脂肪组织：用无菌剪刀和镊子打开腹腔，取出腹腔脂肪组织。小心不要损伤内脏器官。
3. 酶消化：将脂肪组织切成小块，转移到含胶原酶溶液的培养皿中。在 37°C 下孵育 4560 分钟，偶尔摇晃以确保组织完全消化。
4. 过滤：将酶消化后的溶液通过 40100 μm 过滤器过滤，以去除未消化的组织和细胞碎片。
5. 离心：将过滤后的溶液转移到离心管中，在 1000 x g 下离心 57 分钟。
6. 收集脂肪间充质干细胞：小心地收集沉淀，并用无血清培养基洗涤以去除残留的胶原酶。再次在 1000 x g 下离心 57 分钟。
7. 培养：将脂肪间充质干细胞重悬于无血清培养基中，并接种到培养皿或培养瓶中。在 37°C、5% CO2 孵育箱中培养。
提示：使用无菌技术进行整个过程以防止污染。
孵育时间和胶原酶溶液浓度可能根据脂肪组织的特性而有所不同。
筛选分离出的干细胞以验证其间充质特性（如多能分化潜能和表面标记）。
定期监测培养物并更换培养基以维持细胞健康。
