小鼠神经干细胞分离 🐎 （小鼠肝细胞分离获得完整细胞需要注意哪 🐳 些问题）
- 作者: 张璟昂
- 来源: 投稿
- 2025-06-07
1、小鼠 🐛 神经干细胞分离
小鼠神 🍀 经干细胞分 🌾 离
材料小 🐡 鼠 🐬 脑组织
无 🌵 菌 🦍 培 🕷 养基（如 DMEM/F12）
胰 🦆 蛋 🌷 白酶
培 🐈 养 🌷 瓶或培 🐵 养皿
神经干 🐛 细胞 🐒 选择培 ☘ 养基
抗生素（如 青 🌿 霉 🦆 素 🐦 /链霉素）
胰凝乳蛋 🦊 白酶抑制剂
步骤1. 组织收集 🐱
在无菌条件下 🦆 解剖小鼠，取出 🐅 大脑。
将 🕷 大脑放置在 🌷 无菌 🐱 培养基中。
2. 组织 🐱 解离
使 🦋 用胰蛋白酶消化大脑组织。
胰蛋白酶消化时 🌾 间取决 🐡 于小鼠的年龄和大脑大小。
消化后 🐈 ，用 🐼 培养基稀 🐛 释胰蛋白酶并 центрифугировать 细胞悬液。
3. 神经干 🌻 细胞富集 🐳
将细胞悬液接种 🦟 到神经干细胞 🐒 选择培养基 🌹 中。
选择培养基通常含有 🌵 上 🌵 皮细胞生长因 🐒 子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF)。
神 🌸 经干细胞会附着在培养皿上并增殖。
4. 神经 🦟 干细 🐴 胞培 🦍 养
在 37°C、5% CO2 的条件 🦈 下 🦅 培养神经 🐒 干细胞。
定期更换培 🦄 养基并监 🌿 测细胞生 🐺 长。
5. 神经干 🦍 细 🌿 胞分 🌿 离
神 🐋 经干细胞增殖后，可以根据需要 🐘 进行分离。
可使用胰凝 🦢 乳 🍀 蛋白酶抑制 🦆 剂来分离附着的细胞。
神经干细胞悬液可用 🕊 作 🐒 进一步实验或冷冻保存。
注意 🕷 要 ☘ 点 🌼
使用无菌技术以避免 🐴 污 🐡 染。
优化胰蛋 🌾 白酶消化时间 🦟 以获得最佳细 🐯 胞产率和活力。
神经干 🐳 细 🍁 胞培养基应 🍁 新鲜制备。
定期监测神经干细胞生长以确保它们 🦅 处 🌻 于健康状态。
2、小鼠肝细胞分离获 🌷 得完 🦟 整细胞需要注意哪些问题
小鼠肝细胞分离获得完整细胞 💐 的注意事项
1. 动物的 🐳 选择和 🌿 准备
使用健康的小鼠 🐴 ，避免肥胖或有肝损伤的个体。
术前禁食 🐎 1216小 🌵 时 🐟 ，以减少肝血量。
2. 灌 🦉 流 🐺 程序 🐅
使用预冷的灌流 🐵 缓冲液（例如 🐦 Hank's balanced salt solution，HBSS）进行肝脏灌流。
灌流压 🐳 力应控制在1015 mmHg（1.32.0 kPa）。
灌流时间通常为510分钟，或直到流出的灌流液变 🐡 清为止。
3. 肝 🐛 脏胶原 🌲 酶消化
使用胶原酶溶液（例如胶原酶IV或II）消化肝组织 💮 。
胶原 🌹 酶浓度和消化时间应根据所使用的 🐶 胶原 🌾 酶类型和肝脏大小进行优化。
通常的消化时间为 🦊 1530分钟，或直到肝组织呈松 🐠 软状态。
4. 细 💐 胞 🐴 分 🍀 离
将 🦅 消化后的肝细胞悬液过滤通过细胞滤70100μm网。
通过离心（200300g，5分钟）沉 🦟 淀细胞。
用新鲜培养基重悬细胞，并重复离心步骤以清洗 🦄 细胞。
5. 细胞培养 🐴
将分离出的肝细胞接种 🐞 在预先涂覆胶原或马特 🌵 胶的培养皿中 🐯 。
使 🐡 用含 🌿 有生 🦉 长因子的培养基培养细胞。
对于长期培养，定期更换 🌲 培 🐴 养基并监测细胞活力。
其他 🐬 注意事 🌷 项
无菌操作：整个 🐠 过程必须无菌操作，以防止细胞污染。
温度控制：所有步骤中保持细胞悬 🐵 液和缓冲液的温度在4°C左右，以维持细胞完整性。
避免过度消化过度消化：会破 🌴 坏细胞膜，导致细胞死亡。
细胞 🦄 计数和活力评估：使用细胞计数板或流式细胞仪对分离出的细胞进 🦊 行计数和活力评估。
3、小 🦋 鼠神经干细 🐼 胞的分离及培养实验
材料C57BL/6 小鼠 🌼
Dulbecco's PBS (DPBS)
神经干细胞 🐯 培养基 🐴 ：DMEM/F12、B27 补充剂、EGF、FGF2、谷 🐳 、氨酰胺抗生素抗真菌剂混合物
0.25% 胰 🐡 蛋白酶 🦟 /EDTA 溶液
PolyL鸟氨 🦅 酸 🐵
100mm培 🐛 养 🦆 皿 🐅
6孔板显微镜
步骤
1. 小鼠 🌷 脑分 🐕 离 🌳
将 🐱 小鼠麻醉并安乐死。
取出小鼠颅骨，将其 🌵 放入装有 DPBS 的培养皿 🌾 中。
小心移除脑组织，将其转移到新的 DPBS 培养 🦄 皿中。
2. 脑组织 🌲 切割
使用显微解剖 ☘ 刀将脑组织切割成小块。
将小块脑组织转移 🐴 至装有 0.25% 胰蛋 🐺 白酶 🦍 /EDTA 溶液的培养皿中。
3. 酶解 🐳
在 37°C 的培养箱中孵育 30 分 🐴 钟，轻 🐟 轻摇晃。
每 10 分钟用 🌲 移液管吹打组织，以释放神经干 🐶 细 🐘 胞。
4. 离 🍀 心 🐅
离心细胞悬液以去 🐬 除 🐝 细 🐠 胞碎片。
收集沉淀 🌺 物并用神 🦄 经干细胞培养基重悬 🐴 。
5. 细胞培养 🌸
将细胞悬液接种到涂有 PolyL鸟氨酸的 100mm 培养皿 💐 中。
在 37°C、5% CO2 的培 🐒 养箱 🐎 中培养 🐳 。
6. 神 🌵 经干细 🐵 胞分离
培养 710 天后，神经干 🦄 细胞将形成神经球。
使 🐛 用移液 🐘 管轻轻吹打神经球，以使其 🪴 脱离培养皿。
收集神经球并将它们转 🐒 移到新的培养基中。
7. 继 🐛 续培 🐟 养 🐒
继续在神经干细胞培 🦍 养基中 🐺 培养神经球，每 34 天更换培养基一次。
神经干细胞可以在体外长 🦅 期培养，并 🌺 保持其多能性。
培养基 🦍 成 🌿 分
DMEM/F12：基础培 🦈 养基
B27 补充剂：含有多种神 🐡 经生长因子和激素
EGF：表皮生长因子 🐛 ，促进神经干 🌵 细胞增殖
FGF2：成 🐦 纤维细胞生长因子2，促进神经干细 🐝 胞存活
谷氨酰 🐧 胺：必需氨基酸，支持 🐡 细胞代 🦍 谢
抗生素抗真菌剂混合物 🐬 ：防止细菌和 🐼 真菌污 🌷 染
4、小鼠 🌼 神经 🪴 干细胞分离原理
小 🌹 鼠神经干 🦍 细胞分离原理
1. 组 🦟 织 🐡 解离 🌹
收集胚胎或成年小鼠的脑组织，切碎并消化酶处理以解离细 🌻 胞。
2. 密 🦟 度梯 🦉 度离心
使用密度梯度离心将细胞按密度分层。神。经干细 🐴 胞位于较低密度的层中
3. 抗体 🐱 标 🌲 记 🌾
使用神经干细胞 🦆 特异性标记（例如 Nestin、CD133、Sox2）的 🌷 抗体对细胞进行标记。
4. 荧光激活细胞分 ☘ 选（FACS）
使用流式细胞仪将标记的神 🦄 经干细胞从其他细胞中分选出来。
5. 神经球 🌷 培养
分选后的神经干细胞在神经球培养 🐶 基中培养，形成神 🦋 经球（由神经干细胞和神经祖细胞组成的聚集体）。
6. 神经球贴 🌻 壁培 🐳 养
神经球贴壁培养，允许神经干细胞 🐕 扩增并分化为神经元 🌸 、少突 🦈 胶质细胞和星形胶质细胞。
关 🐞 键 🪴 要点 🐒 ：
不 💮 同的组织来源、分离方法和培养条件可能会导致神经干细胞分离效率的 🐬 不同。
神经 💮 干细胞的鉴定依赖于特异性标记的抗体和其他技术。
神经球培养提供了一个控制神经干细胞 🌺 分化和增殖的环境。
