如何培养 🍀 小鼠干细胞（如何培养小鼠干细胞 🌴 分离）
- 作者: 郭橙美
- 来源: 投稿
- 2025-05-13
1、如何 🐛 培养小鼠干细胞
材料:小鼠 🐘 胚胎 🐟 （E13.514.5）
无血清 🦍 培养基（如DMEM/F12）
胚 🌳 胎干细胞培 🐱 养基（如培养基 🌳 ESC含，LIF）
培养板或 🐦 培养 🐈 皿 🕸
吸管 🐶 和移液枪 🐺
显微镜细 🌼 胞 🌲 刮刀 🌺
胰 🐯 蛋白酶溶液
70% 乙 🦁 醇
步骤:1. 解剖小 🐋 鼠胚胎：
用70% 乙 🌳 醇消毒Embryo dissection apparatus
在无菌条件下切开头部的 🐶 皮肤和肌肉，取出胚胎。
将胚胎放入 🦍 无血清培养基中。
移除胚胎头部 🐼 的内脏和神经管。
将剩 🌲 余 🦄 的胚胎组织 🐕 切碎成小块。
2. 消 🐛 化 🐘 组 🦄 织：
将切碎的组织转移到含有 🐺 胰蛋白酶溶液的 🌴 培养板中。
在37°C 培养 1015 分钟，每隔几分钟搅拌一次以确保均匀消 🕸 化。
3. 终止消化 🐡 ：
添加胚胎干 ☘ 细胞培 🦄 养基以终止消化过程。
用吸管小心吹打 🐒 细 🐠 胞悬液 🐦 以分解团块。
通过细胞滤网过滤细胞 🐬 悬 ☘ 液以去除未消化的组织碎片。
4. 离心和收集 🌼 细胞：
将细 🐧 胞悬液以 🌷 300 x g 离心 🌷 5 分钟。
小心地移除上清液并用胚胎干细 🦁 胞培养基重悬细胞。
5. 培 🐱 养 🐈 细胞 🐵 ：
将细胞接种到涂有明胶或未涂层的培养板或培养 🐵 皿中。
每隔几天更换一次胚胎干细胞培养 🦁 基。
观察细胞生长并 🐘 去 🪴 除分化的细胞。
6. 扩 🦈 增干 🍁 细胞 🐶 ：
当细 🐡 胞达到 7080% 的汇合度时，用细胞刮刀小心刮下它们 🌴 。
将细胞 🐝 重新悬浮在新鲜的胚胎 🐱 干细胞培养基中 🐋 。
将 🦄 细胞重新接种到新的培 💐 养板或培 🐈 养皿中。
注意事 🦋 项:
保持无 🌿 菌操作以 🌴 防 🦍 止污染。
定期更换 🦅 培养基以提供营 🐒 养并防止毒素积累 🐝 。
仔细监测 🦅 细 🍁 胞生长以识别和去除分化的细胞。
如果细 🌵 胞生长缓慢或出现污染 🌻 迹象，请重新开始培养过程。
2、如何培养小鼠干 🐕 细胞分 🦊 离
小鼠干细胞分离培 ☘ 养步骤
材料胚胎小 🐼 鼠（例如 C57BL/6）
无菌手术 🐒 设备 🐎 （如剪刀、镊子）
无 🐎 菌培养皿和培养基 🐒 （如 DMEM、FBS）
细胞培养 🌺 箱（37°C、5% CO2）
干细胞培养 🐵 基（含 🌲 LIF）
抗生 🐳 素（如青霉素、链 🌷 霉素）
步骤1. 胚 🦅 胎 🐺 收集 🌷
处死妊娠 🌺 12.513.5 天的胚胎小鼠。
从子宫中取 🦄 出胚胎并将其放入无菌培养皿中。
2. 胚 🐺 胎 🦍 解 🌷 剖
使用 🌻 无菌 🐞 剪刀和镊子去除胚胎的头和内脏。
保留 🌷 胚 🐺 胎的躯干部分（称为胚胎 🦆 干“细胞体”）。
3. 胚胎干细胞体解离 🦅
将胚胎干细胞体 🐡 切成小块。
使用无 🌷 菌胰酶和胶原酶消化小块片刻。
通过细胞滤器过滤消化后的 🐛 细胞 🐶 悬液以去除细胞团。
4. 干细 🐞 胞培 🕊 养
将细胞悬液接种到含 🍁 有干细胞培养基的无菌培养 🌲 皿中。
加入 🐶 抗 🐼 生素以防止细 🐬 菌污染。
将培养皿置于 37°C、5% CO2 的细胞 🌸 培养箱中。
5. 细胞扩增 🦋
每 🌸 23 天更 🐳 换培养基，同时去除死亡细胞和细胞碎片。
细胞每隔一段时间通过传代来扩增 🕊 ，以保持活力和增殖能 🐒 力 🪴 。
提示使 🐠 用高品质无菌材料和培养基。
在无菌条件下进 🌲 行所有操作，以防止污染。
监 🌳 测细胞形态 🐞 和增殖速率，以确保细胞健康。
使 🦁 用 LIF 等生长因子促进干 🪴 细胞的自更新。
定期使用流式细胞 🌾 术或免疫组织化学验证干细胞特性。
3、如何培养 🦄 小鼠干细胞储存
培养小鼠干 🌿 细胞 🐵 储存的步骤：
1. 制 🐟 备胚胎 🕊 干 🐧 细胞 (ESC)
从 E3.5E4.5 天 🦅 胚胎 🦉 的内细胞团中分 🐎 离。
在含 LIF 或 bFGF 等生长因子的培养基 🦋 中培养。
2. 诱 🐬 导出小鼠诱导多能 🐋 干细胞 (iPSC)
使用逆转录 🐱 病毒或转座子系统将 Oct4、Sox2、Klf4 和 cMyc 基因转染到小鼠 🦟 胚胎成纤维细 🐼 胞或 (MEF) 其他体细胞中。
在含生长因子的培养基中培养，并 💮 通过抗生素选择培养不分化的 iPSC 菌落。
3. 培 🌷 养条 🦅 件
ESC 和 iPSC 培养在 🪴 标准细胞培养条件下 (37°C、5% CO2)。
使用无血清培养 🐋 基，如 DMEM/F12、N2 和 B27 补液。
培养在涂有明胶或聚维酮的 🐯 组织 ☘ 培养皿或 🐵 培养瓶中。
每 23 天更换培 🐎 养 ☘ 基，并 🌳 根据需要传代细胞。
4. 维持未 🐕 分 🦍 化 🐳 状态
ESC 和 iPSC 必须保持未分化状 🐬 态，才能保持其 🌸 多能性。
需要补充 🐎 生长因子（如 LIF 或或 bFGF）使（用抑 🐘 制分化的小分子抑制剂如 PD）。
避开诸如 DMSO 等分化诱 🐕 导剂。
5. 传 🐴 代 🐯
当细胞达到 7080% 融 🐴 合度时 🐒 ，传代细胞。
用胰蛋白酶消化细胞，并将其 ☘ 分散成较小的簇。
在新的培 🦟 养皿或培养瓶中重新接种细 🌸 胞，并补充新鲜培养基。
6. 冷 🐛 冻保 🐳 存 🌵
为了长期储存，将小鼠干细胞在 80°C 冷冻保 🦄 存。
将细胞悬浮在 🐶 冷冻保存液中，例如 DMSO 或 cryoprotectant。
将细 🐦 胞放入冷冻管 🌹 中，并 🦈 将其放置在液氮罐中。
提示：使用高 🦁 质量的培养基和试剂。
保持无 🦋 菌 🐬 操作条件。
定期 🪴 监测 🐱 细胞生长和形态。
及时冷 🪴 冻保存细胞以备将来使用。
4、如 🐞 何培养小鼠干细胞移植
如 🐳 何培养小鼠干细胞移 🕷 植
材料：小 🐳 鼠胚胎干细胞 (ESC)
无血 🐦 清 🐞 培养基（如 N2B27 或 DMEM/F12）
LIF（白血 🐒 病 🌴 抑制 🦁 因子）
胶原 🍁 酶 IV
透 🕷 明 🐼 质酸 🐦 酶
胰 🕊 蛋白 🌲 酶 🦁
接 🕷 收 🐋 小鼠 🦄
方法：1. ESC 培养 🌺 ：
将 🐝 ESC 种植在含 LIF 的无血清培养基中 🐦 。
每 🌾 23 天传代一次，以保持细胞生长和活力。
2. ESC 分化成神 🐒 经 🐯 祖细胞：
将 ESC 置于含胶原酶 IV 和透明质酸酶的 ☘ 培养基中 60 分钟。
用胰蛋白酶解离 ESC，然后接种到含 🌷 N2B27 培养基的新培养皿中。
培养 57 天，让 ESC 分化为神经 🦋 祖细 🦍 胞。
3. 神 🐅 经祖细胞移植：
将 🌷 接收小鼠麻醉。
在小鼠头皮上切 🌳 一个小切口，暴露大脑皮层 🌸 。
使用玻璃移液管将神经祖细 🕸 胞悬液注入大脑皮 🕷 层。
缝合切 🌹 口 🌾 。
4. 移 🐛 植 🐞 后护理：
给小鼠 🐺 注射镇痛药 🐺 。
在移植后 12 周内监测小鼠 🦅 的健康状况。
移植后 48 周进 🐴 行组织学分析，以评估移植的成功性。
注 🐟 意事项 🐛 ：
严格遵守无菌 🐧 技术，以防止 ESC 培养物受污 🐛 染。
仔细监测神经祖 🐝 细胞的 🐼 分化情况，以确保它们达到移植的所需成熟阶段。
在进行移植前，向，兽医咨询以获得有 🕸 关接 🐋 收小鼠护理 🐬 和麻醉的指导。
移 🌼 植后 🐕 定期进行 💐 组织学分析，以跟踪移植的进展和评估其长期效果。
