分离小鼠多能干细胞（分离小鼠原代成纤维细胞时,需要受孕多少天的小鼠）
- 作者: 马瑾伊
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、分离小鼠多能干细胞
分离小鼠多能干细胞
材料：小鼠胚胎（8.59.5天）
Dulbecco's phosphatebuffered saline (DPBS)
0.25%胰蛋白酶溶液
ES 培养基（含有 LIF 或 bFGF）
6 孔培养板，带孔的
细胞刮刀
显微镜步骤：
1. 采集小鼠胚胎：从怀孕 8.59.5 天的小鼠中采集胚胎。
2. 剥离内细胞团：使用解剖剪刀和显微镜，小心地剥离内细胞团（ICM）。
3. 解聚内细胞团：将 ICM 转移到装有 DPBS 的培养皿中，用干净的细胞刮刀将其解聚成小团。
4. 消化内细胞团：向 ICM 悬浮液中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 510 分钟。
5. 终止消化：加入 4 mL ES 培养基（含有 LIF 或 bFGF）终止胰蛋白酶活性。
6. 过滤：将细胞悬浮液通过 40 μm 滤网过滤去除细胞团。
7. 离心：将细胞悬浮液离心 5 分钟，1200 rpm。
8. 重悬细胞：重悬离心后的细胞于 ES 培养基中。
9. 铺板：将细胞悬浮液接种到已铺好的 6 孔培养板中。
10. 培养：在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。
提示：操作应在无菌条件下进行。
使用适合小鼠胚胎培养的培养基。
培养时间和条件可能根据使用的细胞系而异。
分离出的多能干细胞可以进一步培养或冷冻保存。
2、分离小鼠原代成纤维细胞时,需要受孕多少天的小鼠
1315 天
3、小鼠肝细胞分离获得完整细胞需要注意哪些问题
小鼠肝细胞分离获得完整细胞的注意事项
1. 组织获取和准备
使用新鲜、健康的肝脏组织。
用冷缓冲液冲洗肝脏并去除多余的血液和组织碎片。
使用锋利的剪刀或刀片将肝脏切成小块。
2. 肝细胞分离方法
胶原酶消化法：使用胶原酶将肝脏组织分解成单个细胞。选择合适的胶原酶类型和浓度，以最大限度地获得完整细胞。
肝灌流法：通过门静脉向肝脏灌注胶原酶溶液，将肝细胞冲洗出来。这种方法通常能获得较高的细胞产率。
3. 组织消化条件
温度：通常在37°C进行消化，以促进酶活性。
时间：消化时间根据肝脏的大小和所用酶的不同而异。一般为1530分钟。
摇晃：持续轻柔摇晃以促进酶与组织的接触。
4. 过滤和分离
将消化后的组织悬液通过70100 μm的细胞滤网过滤，去除未消化的组织碎片。
使用梯度离心或洗脱液去除死细胞和碎片。
5. 细胞清洗和培养
用培养基反复洗涤肝细胞以去除残留的消化酶。
在合适的培养基中培养肝细胞，并监测细胞活力和形态。
6. 其他注意事项
抗氧化剂：添加抗氧化剂（如谷胱甘肽或N乙酰半胱氨酸）以保护肝细胞免受氧化应激。
钙离子：保持培养基中钙离子的适当浓度，以促进细胞粘附。
细胞密度：避免过高的细胞密度，因为这会抑制细胞生长和分化。
细胞培养基：选择富含营养素和生长因子的培养基，以维持肝细胞的健康。
4、小鼠肝细胞的分离技术和影响因素探讨
小鼠肝细胞的分离技术
1. 机械分离
两步离心法：将肝组织悬浮液在低速下离心去除肝细胞外基质和碎屑，然后在高速下离心收集肝细胞。
Percoll 密度梯度离心：利用 Percoll 溶液形成密度梯度，肝细胞在不同密度层中沉降，可得到纯度较高的肝细胞。
2. 酶消化法
胶原酶消化法：使用胶原酶消化肝组织，将细胞之间的胶原酶解断裂，释放肝细胞。常用胶原酶 IV 或 VII。
Pronase 消化法：使用 Pronase 消化肝组织，可水解蛋白质和多肽，也可释放肝细胞。
3. 免疫磁珠分离法
使用标记有抗肝细胞表面抗原的磁珠，与肝细胞结合，通过磁力分选收集肝细胞。
影响分离效率的因素
1. 肝组织来源
不同来源的肝组织，如健康小鼠或疾病小鼠，肝细胞的分离效率和特性可能不同。
2. 消化酶类型和浓度
消化酶的类型和浓度会影响肝细胞的产量和活力。
3. 消化时间和温度
适当的消化时间和温度对于获得高纯度和高活力的肝细胞至关重要。
4. 离心条件
离心速度和时间会影响肝细胞的分离效率。低速离心可去除碎屑，高速离心可收集肝细胞。
5. 培养基和补充剂
培养基和补充剂的成分和浓度会影响肝细胞的增殖和分化。
6. 肝细胞表面抗原的表达
肝细胞表面抗原的表达可能会影响免疫磁珠分离法的效率。
7. 细胞保存条件
分离后的肝细胞需要保存在适当的条件下，如冰上或液体氮中，以保持其活力。
