提取小鼠肌腱干细胞（小鼠肝细胞的提取及培 🦍 养实 🕷 验）
- 作者: 马希柠
- 来源: 投稿
- 2025-05-16
1、提取小鼠肌 🐦 腱干 🌷 细胞
材料：68 周 🕷 龄 C57BL/6 小鼠 🍀
无菌 🐛 器 🦊 材 🐈
消毒剂（如 70% 乙 🐛 醇 🐵 ）
PBS（pH 7.4）
胶 🌲 原 🐶 酶 IV（50 U/mL，爱美科 🕊 ）
血 🦅 清蛋 🐼 白 🌾 酶（2.5 mg/mL，SigmaAldrich）
杜氏改良鹰 🦍 氏培养基（DMEM）+10% 胎牛血清 ☘ （FBS）
筛选培养基：DMEM + 10% FBS + 100 ng/mL 成纤维细胞生 🐺 长因 🐼 子（FGF2，PeproTech）
步骤：1. 解 🐯 剖 🌷 小鼠 🦊 ：
安 🐈 乐 🐶 死小鼠，并用消毒剂擦拭。
将小鼠解 🐋 剖并 🐯 取出后腿。
2. 提 🦄 取 🐳 肌腱：
去除 ☘ 后腿上的皮肤和肌 🌸 肉 🐼 ，露出肌腱。
小心地将肌腱从骨头和韧带上 🐳 分离。
3. 酶 🌷 消化：
将肌腱切成小 🐎 块，放 🐘 入含胶原酶 IV 和血清蛋白酶的溶液中。
在 37°C 孵育 🌴 12 小时，定期涡旋。
4. 过 💐 滤 🌻 ：
将消 🦆 化后的 🦁 组织液通过 40 μm 细胞滤 🐱 网过滤。
用 🕷 PBS 冲洗细胞 🌺 滤网以收集 🐎 细胞。
5. 离 🐟 心 🌸 ：
将细胞悬液在 1,200 rpm 下离心 🐡 5 分钟。
丢弃上清液 🌼 。
6. 重 🐎 悬：
将沉淀 🐧 物重悬于筛选培 🦢 养基中。
7. 培 🐅 养 ☘ ：
将细胞悬液接种到培养皿 🌾 中。
在含 🌿 5% CO2 的 37°C 培养箱 🦄 中培养。
8. 筛 🐡 选：
每 23 天更换一次培养基 🐱 。
714 天后，筛选出具有肌腱干细胞特征的细胞（参见 🐠 附录）。
附录：肌 🌵 腱干细胞的特征
附着于培养基 🌵 板并 🦋 呈梭形
表达肌腱标记物，如 🦋 腱蛋白 I 型和型 III
多能性，分化为成 🦄 骨细胞成、软骨细胞和成纤维细 🐟 胞
2、小鼠肝细胞的 🌴 提取及培养实验
材 🐴 料和试 🌼 剂
小鼠含肝 🦉 素 🌵 和EDTA的 🌴 PBS
коллагеназаIV
丙二醇DMEM/F12培 🕷 养基 🌿
胎 🦈 牛血清（FBS）
青霉 🍁 素/链霉素
胰 🦁 蛋 🕸 白 🐵 酶EDTA
0.25%胰 🐈 蛋白酶 🐧
细胞培养 🐒 板和培养瓶
无菌吸 🐼 管和移 🌻 液枪 🐺
方法小 🍀 鼠肝细胞的 🍁 提 🦟 取
1. 处 🐟 死小鼠，在无菌条件下切除肝脏。
2. 用冷PBS冲洗肝 🐋 脏，去除多余的血液。
3. 将肝脏切成小块，在盛有含肝素和EDTA的的 🍁 PBS平板上研磨。
4. 过滤研磨液，去除细胞碎片和残留的 🌾 组织 🐞 。
5. 将过 🐅 滤液离心（300 x g，10 分钟）沉 🍀 淀细胞。
6. 用含肝 🐳 素和EDTA的PBS重悬细胞 🐶 。
小鼠 🍁 肝细胞的培养
1. 将细胞重悬 🦟 液在预涂有 🪴 胶原酶IV的培养板中培养 12 小时，以促进细胞附着。
2. 用DMEM/F12培养基（含10% FBS和1%青/霉素链霉素）去除 🐘 未附着的细胞。
3. 更换新 🌷 鲜培养基，并在培养37°C、5% CO2箱中培养细胞。
4. 每隔 🍁 23天更换培养基一次 🦆 ，直 🐳 至细胞达到8090%的融合度。
细胞传代1. 用0.25%胰蛋白酶处理细胞，直至细胞从培 🐺 养板脱离。
2. 用含10% FBS的DMEM/F12培养 🐯 基停止胰蛋白酶消 🦊 化。
3. 离心细 🦁 胞（300 x g，5 分钟）并重悬在新鲜培养基中。
4. 将细胞分播到新的培养板或培 🦟 养瓶中，并按上述培养方法培养。
注意事项整个过程中保 🦄 持 🐦 无菌条件。
使用新鲜的胶原酶IV，过IV期的胶原 🐝 酶会影 🌻 响 🦁 细胞附着。
细胞培养基应定期更换，以提供细 🐘 胞生长和分化的 🌲 必需 🕸 营养物质。
避 🌺 免过度传代，因为这可能 🐞 会影 🌸 响细胞的功能和活力。
3、提取小鼠肌腱干细胞的 🐶 方法
提取小 🌿 鼠 🐝 肌腱 🍀 干细胞的方法
材料：68 周龄 C57BL/6 小鼠 🐦
无 🐠 菌 🪴 手术器械
无菌培 🌳 养基 🦍 （αMEM，含 10% FBS）
胶 💐 原 🌲 酶 I（5 mg/mL）
PBS细 🦢 胞培 🦄 养瓶 🐅
超净工作 🦁 台
步骤：1. 麻醉小鼠：使 🌹 用异氟烷或其他合适的麻醉剂麻醉 🌲 小鼠。
2. 无菌手术：在超 🌼 净工作台中，按无菌 🦉 手术 🐶 程序准备手术区域。
3. 提取肌 🐝 腱 🍀 组织：将小鼠的四肢或尾巴固定，用，手术剪刀或刀片取下足部屈肌或尾腱周围的肌肉组织露出肌腱。
4. 酶消化：将肌腱组 🐧 织转移到装有胶原酶 I（5 mg/mL）和 PBS 的培养皿中。在 37°C 下孵育 1 小时 🍁 ，每 15 分。钟轻柔地摇晃一次
5. 终 🐦 止消化：加入等体积的无血清培养基 🐒 终止消化。离。心收集细胞悬液 🦆
6. 重悬细胞：用无 🦋 血清培养基将细胞重悬，然 🐋 后过细胞过 100 μm 滤网。
7. 培养：将细胞转移到预先涂有胶原 I 的细胞培养瓶中 🐦 。用培养 αMEM 基（含培养 10% FBS）并，每 23 天。更换培养基
鉴定：提取的 🐶 细胞可以通过以下标志物鉴定为 🐺 肌腱干细 🐴 胞：
表面 🌷 标志 🦁 ：CD44、CD105、CD73
分化潜能：可 🌾 分化为成肌细胞成、软骨细胞和成骨细胞
提示：无菌技 🦅 术至关重要，以防 🌷 止污染。
消化时 🦅 间和胶原酶 I 的浓度可能需要根据肌腱组织的坚韧程度进行调整 🐧 。
提取后，细，胞应尽快培 🌿 养以保持其活力。
4、提取小鼠肌腱 🦢 干细胞的 🐠 原理
提取 🦅 小鼠肌腱干 🌻 细胞的原理
提取 🐅 小鼠 🐡 肌腱干细胞的原理基于干 🌻 细胞的特性，包括：
1. 自我更新能力：干 🌳 细胞具有自我复制 🦟 的能力能，产生具有与自身相同分化潜能的 🐅 新细胞。
2. 多向分化潜能：干 🌷 细胞可以分化为 🦅 多种特化的细胞类型，包括肌腱细胞。
3. 特异性标记：干细胞可以表达特定的表面标记，用于区分它们与其他细胞 🌴 类型。
提取 🐴 过程 🦅 ：
提取小鼠肌腱干细 🌳 胞 🕊 的步骤如 🌻 下：
1. 小鼠肌腱组织采集：从小鼠身上 🌾 取出肌腱组织，如 🌴 尾肌腱。
2. 消化：使用酶，如，胶原酶 🌳 将肌 🐘 腱组织分解成细胞悬液。
3. 细胞分离 🕊 ：使用免疫磁珠或细胞分选仪，根据干细胞的表面标 🌺 记（如Sca1、CD44、CD105）对细胞进行分 🐯 离。
4. 细胞培养：将 🕊 分离的细胞培养在含有生长因子的特定培养基中，以促进干细胞的增殖和分化。
5. 验证：使用免疫细胞化学染色或流式细胞术验证分离细胞的干细胞特性，如多向分化潜能和表 🐛 面标记表 🦈 达。
注 🐴 意 🌾 事项：
干细胞的分化能力和稳定性受培养 🦍 条件的影响。
细胞提取和分离过 🐅 程必须 🌴 谨慎进行，以避免细胞损伤或污染。
验证干细胞特性非常重 🐎 要，以确保所分离的细胞确实是肌腱干细胞。
