小鼠股骨提取干细胞（骨片 💐 法提取小鼠间充质干细胞）
- 作者: 郭艺澄
- 来源: 投稿
- 2025-06-26
1、小鼠股骨提取干细 🦆 胞 🌷
小鼠股骨干细胞提 🐝 取 🐼 步骤
材料：68 周龄 ☘ C57BL/6 小鼠 🐟
无菌手术器械 🐴
无 🌹 血 🐦 清培 🐎 养基（DMEM/F12）
胎 🐅 牛 🐦 血清 🦊 （FBS）
抗生素（青霉素/链霉 🐦 素）
细 🐅 胞 🐬 裂解缓冲 🕊 液
标 🌲 记 🐈 抗体（CD45、CD31、Sca1、CD117）
流式细 🕷 胞 🦄 仪 🦋
步骤：1. 小鼠 🦍 处死和股骨切除
按 🕸 照伦理准则处死小 🐦 鼠。
移除皮毛并 🌺 用 70% 乙醇 🌳 消毒手术部位 ☘ 。
使用 🦟 无菌剪刀和 🐵 镊子切开小鼠两侧大腿部的皮肤和肌 🐵 肉，露出股骨。
小心切除股骨，并将其放置在无血 🐶 清培养基中 🐛 。
2. 骨 🐞 髓冲洗
用 25 号 🌷 针头和 1 mL 无血清培养基反复冲洗每个股 🐠 骨的骨髓腔。
将冲洗液转移到 🌺 50 mL 离心管 🦈 中 🐵 。
3. 红 🌵 细胞溶解
加入 1 mL 细胞 🐞 裂解缓冲液到离心管中 🌴 ，涡旋混匀。
孵育 🐕 15 分 🐝 钟，4°C。
离 🕊 心 5 分 🐯 钟，1500 rpm。
弃上清液，并用无 🦅 血清培养基重悬细胞沉淀 🐞 。
4. 标 🕷 记和分选
根据制造 🕸 商的说明，用标记抗体标记细胞。
用流 🐒 式细胞仪 🐝 分选出 Sca1+/CD45/CD31/CD117+ 的/造血干祖细胞 🌻 （HSC）。
5. 培 🕊 养 🕸
将分 🐡 选出的 HSC 接种到含 10% FBS 和抗生素的 DMEM/F12 培养基中。
在 37°C、5% CO2 培养 🍀 箱中培养 🐒 细胞。
6. 扩 🐯 增和 🐶 维持 🌸
每 23 天 🐡 更换一次培养基，并根据需要 🕊 传代细胞。
细胞可以扩增至 1015 代，仍然保持其 🐘 多能性。
提示：使用无菌技术至关重要，以避免污 🐒 染。
分选时选择纯 SCA1+ 细胞群体至关重 🦁 要。
细胞培养期间应监测细 🐼 胞形态和生长速度。
2、骨片法提取小鼠间 🌿 充质干细胞
骨片法 🌹 提取小 🌺 鼠间 🐼 充质干细胞
材 🐘 料和试 🐱 剂 🦆 :
小鼠骨髓骨 (例如 🐧 股骨和 🦋 胫 🐘 骨)
无 🐋 菌 🐠 条 🦍 件下的工作台
70% 乙 🍁 醇
无菌磷 🪴 酸盐缓冲液 (PBS)
罗氏灭菌液 (或其他消毒 🐱 剂)
胰蛋白 🌴 酶消化 🦍 液 (0.25%)
DMEM 培养基 🐅 ，含 10% 胎 🦁 牛血清 (FBS)
培养板细胞 🌵 刮 💐 刀 🕷
离心机流式 🐘 细胞仪
步骤:1. 骨髓骨解剖和切 🐝 碎
在无菌工作台中使用 70% 乙醇对 🦉 工作台表面进行消毒。
使用罗氏灭菌液对小鼠进行消 🐕 毒。
处死小鼠并将其股 🐺 骨和胫骨 🕷 取出。
在无菌环境中切开骨髓腔 🦟 ，并使用细胞刮刀或刮匙收 🐶 集骨髓。
2. 胰蛋白酶 🕸 消 🐠 化
将骨 🐛 髓悬浮在胰蛋白酶消化液中，并搅拌均匀。
在 37°C 孵 🌸 育 🕷 30 分钟，偶尔混匀。
3. 终止消 🦁 化 🌳 和离心
终止消化过程，加 🐦 入等体积的完全培养基 (DMEM + 10% FBS)。
将细 🐡 胞悬浮 🐞 液离心 5 分钟，500 x g，4°C。
4. 红细 🐴 胞裂解 (可选)
如果需要去除红细胞，可使用红细胞裂解 🕸 缓冲液处理细胞悬浮 🐼 液。
5. 培养 🪴
将细胞悬浮液接种 🌲 到培养板上，并在 37°C、5% CO2 的条件下培养。
每 23 天 🦅 换液一次 🐈 。
6. 细胞 🕊 分离和 🦅 筛 🐝 选
培 🐡 养 710 天后，细胞会附 🐦 着 🐧 在培养板上。
使用 🌵 细胞刮刀收集细胞并 🐕 进行离 🐬 心。
使用流式细胞仪筛选间充质干细胞使用，合，适的细胞 🦟 表型标记例如 CD44、CD73、CD90 和 CD105。
注意 🦉 事 🌻 项 🐴 :
始终在 🦆 无菌条件下操作。
使用新鲜的小 🦋 鼠骨髓 🦁 骨。
优化胰蛋白 🕷 酶消化时间以获得最佳 🪴 细胞产量。
流式细胞仪筛选中要使用合适的 🦊 对照。
培养间充质干 🐵 细胞时要保 🌳 持 🌹 无菌条件。
3、小鼠骨髓间充质干细胞提 🐴 取
小鼠骨髓 🌸 间充质干细胞提 🐺 取
材料安乐死的 🦁 小鼠 🐳
无 🐅 菌手术器具
DMEM/F12 完全 🌼 培 🐘 养基 🐯 （含 10% FBS）
1x PBS
红 🐞 细 🦅 胞裂 🐋 解液
胶 🦉 原 🦅 酶 🐯 IV
胰 🐟 蛋 🕷 白酶 🐅
胰凝乳蛋白酶 🦍 抑制 🐼 剂 🕷
离心管细胞 🐯 培养皿 🌻
培养箱步骤
1. 小鼠 🐯 安乐死：按照小鼠安乐 🐟 死的相关指南进行操 🌾 作。
2. 骨髓 🌸 提取：
用 70% 乙醇对小 🌻 鼠皮肤进行消毒。
用无 🪴 菌剪刀剪开小鼠 🐯 股骨的的末端。
用针头从股骨中抽出骨髓 🐡 ，放入无菌 🦆 离 🐎 心管中。
3. 红 🐡 细胞 🐒 裂解 ☘ ：
向骨髓 🌼 中加入 1 mL 红细胞裂 🌹 解液，在室温下孵育 5 分钟。
补充 🐺 DMEM/F12 完全 🌾 培养 🐬 基至 10 mL，然后 centrifugation (300 x g, 5 分钟)。
4. 酶 🦍 消 🌷 化：
弃去上清液，加入含有 400 U/mL 胶原酶 IV 和 100 U/mL 胰 🌲 蛋白酶的 DMEM/F12 完 🌾 全培养基 5 mL。
在 37°C 下孵育 60 分钟，每分钟 🕷 15 用移液管吹打一次。
5. 终 🦆 止消 🦢 化 🌻 ：
补充 🐼 含有 10% 胰 🍀 凝乳蛋白酶抑制剂的 DMEM/F12 完全培养基 5 mL， centrifugation (300 x g, 5 分钟)。
6. 培 🕸 养：
弃去上清 🐱 液 🐟 ，将细胞重悬于 DMEM/F12 完全培养基中。
将细胞接种 🦍 到细胞培养皿中。
将细胞培养箱 🐘 置于 37°C，5% CO2，饱和湿度的条件 🌲 下。
后续步骤细胞计数和活力检测：可以定期对细胞进 ☘ 行计数和 🌴 活力检测以，评估细胞的生长状况。
分化诱导 🍀 ：间充质干细 🌳 胞可以分化成多种细胞类型可以，通过添加特定的诱导因子来诱导分 🦢 化。
实 🌷 验应用：提 🐎 取的小鼠骨髓间充质干细胞可用于研究细胞分化、组、织再生疾病建模等方向。
4、小 🐟 鼠脂肪间充质干细胞提取 🐛
小鼠脂肪 🐧 间充质 🦅 干细胞提取
材料：小鼠
无菌 🦟 手 🌹 术工具
脂 🐅 肪 🐕 组 🌴 织
DMEM/F12 培 🐟 养 🐅 基 🦆
胎 🐠 牛血 💐 清 🦈 (FBS)
抗 🦁 生素 (青霉素/链霉素)
胶原 🐬 酶 IV
胰蛋 🌷 白 🕸 酶 🌺
离心管细 🐱 胞培养瓶
方法：1. 腹腔摘取 🐞 ：
麻醉小 🦄 鼠 🦁 。
腹腔切开并 🌸 暴露腹腔脂肪组织。
2. 脂肪 🦋 组织收集 🌳 ：
小心移 🦋 除腹腔脂肪组织，并置于无菌培养皿中。
3. 脂肪组织消 🦋 化 🍁 ：
使用 🐱 手术剪将脂肪组织切成小块。
在脂 🐺 肪组织中加入胶原酶 IV 溶液（1 mg/ml），并孵育 1 小时，37°C，摇晃。
加入胰 🦟 蛋白酶（0.25%）溶液，并孵育 🦢 15 分钟，37°C，摇晃 🐠 。
4. 细胞 🦁 分 🦈 离 🦊 ：
将消化后的脂肪组织悬液转移至离心管，并离心 🐘 5 分钟，1500 rpm。
弃去上清液，并用 DMEM/F12 培养基 🦊 重悬细胞。
再 🍁 次 🦉 离心 🐡 5 分钟，1500 rpm。
5. 细胞培养 🦢 ：
将 🍀 细 🦟 胞重悬于含有 10% FBS 和抗生素的 DMEM/F12 培养基中。
将细胞接种 🐟 于细胞培养瓶中 💮 ，并置于 🦋 培养 37°C，5% CO2 箱中。
每 🌲 23 天 🐛 更换培 🌻 养基。
6. 细胞鉴 🦁 定 🪴 ：
在培养后一周内观察细胞形态。脂。肪间充质干 🌸 细胞通常呈纺锤形或多边形
使用流式细胞术分析 🌲 细胞表面 🌾 标志物 🐡 ，如 CD29、CD44 和 CD105。
诱导细胞分化为 🐳 成骨细胞、软 🌹 骨细胞和脂肪细胞，以确认多能性。
注意 🦍 事 🐅 项：
保持所 🌳 有设备和材料无菌。
在无菌环境下进行所有 🕊 操作。
使 🦍 用新鲜 🌴 的小鼠 🐼 脂肪组织。
严格 🪴 遵循消化和分离步骤的计时和温度 🐝 要求。
定期 🌹 更换培养基以保持细胞活力。
