小鼠脂肪干细胞染色（小鼠脂肪间充质干细胞提取）
- 作者: 朱锦沂
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、小鼠脂肪干细胞染色
材料：脂肪干细胞（从小鼠脂肪组织中分离出来）
染料（例如：尼罗红、DAPI）
培养基荧光显微镜
步骤：1. 细胞培养：将脂肪干细胞接种在培养皿或培养瓶中，用含有血清的完整培养基培养。
2. 染色：在细胞生长到7080%融合时，向培养基中加入适当浓度的染料。染色时间根据使用的染料类型而异。
3. 孵育：将细胞在黑暗中孵育指定时间（例如：尼罗红为20分钟，DAPI为5分钟）。
4. 洗涤：用培养基轻轻洗涤细胞3次，去除多余的染料。
5. 固定（可选）：如果需要长期保存染色细胞，可以使用4%甲醛溶液将细胞固定15分钟。
6. 观察：使用荧光显微镜观察染色后的脂肪干细胞。根据所使用的染料，可以观察到细胞内的脂质滴（尼罗红）或细胞核（DAPI）。
注意事项：
优化染料浓度和孵育时间以获得最佳染色效果。
避免过度染色，因为这可能会影响细胞活力。
始终遵循生物安全准则，谨慎处理染色试剂和细胞。
2、小鼠脂肪间充质干细胞提取
小鼠脂肪间充质干细胞提取
材料：68 周龄 C57BL/6 小鼠
无菌手术室
手术器械（剪刀、镊子、显微镜）
脂肪组织分离液
培养基（含 10% FBS）
6 或 12 孔板
细胞计数器
步骤：1. 麻醉小鼠：使用异氟烷或腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠。
2. 准备手术室：在无菌手术室中设置手术台和工具。
3. 剃除腹部脂肪：剃除小鼠腹部的毛发，并用 70% 乙醇消毒皮肤。
4. 切开皮肤：沿着腹中部线切开约 23 cm 长的皮肤和肌腱。
5. 暴露脂肪：仔细分离皮肤和肌肉，暴露腹部的白色脂肪组织。
6. 收集脂肪组织：使用无菌镊子和剪刀收集脂肪组织，将其转移至培养皿中。
7. 消化脂肪组织：向脂肪组织中加入脂肪组织分离液，进行 3060 分钟的酶促消化。
8. 离心收集细胞：将消化后的混合物离心 5 分钟，1000 g，收集沉淀物。
9. 清洗细胞：用培养基清洗细胞 23 次。
10. 纤连蛋白粘附：将细胞悬浮液接种到预先涂有纤连蛋白的培养皿中。
11. 培养和分离：在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养细胞。观察细胞贴壁并增殖。当细胞达到 8090% 的汇合度时，使用胰蛋白酶进行传代。
细胞鉴定：
使用流式细胞仪或免疫荧光染色对提取的细胞进行鉴定，以确认 CD34、CD45 和 CD90 的表达情况。
注意事项：
确保整个过程中的无菌操作。
小心操作，避免损坏细胞。
使用高纯度的脂肪组织分离液，以获得最佳的细胞分离效率。
3、小鼠脂肪干细胞怎么提取
小鼠脂肪干细胞提取步骤
材料小鼠
无菌手术器械
无菌培养基
离心机红细胞裂解液
培养瓶培养液（含抗生素）
胶原酶溶液
步骤1. 准备小鼠：将小鼠麻醉，然后进行无菌手术准备。
2. 取脂：用无菌手术器械切开小鼠背部皮肤，暴露脂肪组织，然后用镊子小心地剥离脂肪组织。
3. 消化组织：将脂肪组织切成小块，放入含胶原酶溶液的培养皿中，在 37°C 孵育 1 小时，不定期摇晃。
4. 过滤：将消化后的混合物通过 100 微米细胞滤网过滤，滤除碎屑和纤维。
5. 离心：将滤液转移至离心管中，在 1200 rpm 离心 10 分钟。
6. 收集间充质干细胞：吸出上层脂肪并小心地收集位于离心管底部或中间的细胞层。
7. 去除红细胞：将收集的细胞悬浮在红细胞裂解液中，然后在 4°C 孵育 10 分钟，以裂解红细胞。
8. 洗涤：用无菌培养基洗涤细胞，在 1200 rpm 离心 5 分钟，重复 23 次。
9. 培养：将洗涤后的细胞悬浮在培养液中，接种到培养瓶中，在 37°C、5% CO2 条件下培养。
注意事项保持所有材料和设备的无菌性至关重要，以避免污染。
使用新鲜的小鼠脂肪组织，因为储存过的组织可能会影响干细胞的质量。
仔细选择胶原酶溶液的浓度和消化时间，以实现最佳的细胞解离而又不损伤细胞。
培养期间监测细胞的形态和生长情况。
4、小鼠脂肪干细胞提取
小鼠脂肪干细胞提取步骤
材料：雄性或雌性小鼠（体重2025克）
无菌手术器械
无菌培养基和培养皿
胶原酶消化液
离心机血细胞计数板
流式细胞仪（可选）
步骤：1. 小鼠麻醉：给小鼠注射异氟烷或其他麻醉剂。
2. 腹腔切开：沿着小鼠腹中线进行切口，露出脂肪组织。
3. 分离脂肪：小心移除脂肪组织，避免损伤内脏器官。
4. 胶原酶消化：将脂肪组织切成小块，加入胶原酶消化液中，并在37°C下孵育1小时。
5. 细胞分离：通过滤网或离心去除脂肪残渣。
6. 洗涤：用无菌培养基洗涤细胞，去除消化液。
7. 离心：在400 x g下离心10分钟，收集沉淀细胞。
8. 重悬细胞：用无菌培养基重悬沉淀细胞。
9. 计数细胞：使用血细胞计数板计数细胞数量。
10. 鉴定干细胞（可选）：使用流式细胞仪鉴定脂肪干细胞标记物，如CD29、CD34和CD44。
注意事项：
保持无菌环境至关重要，以防止细胞污染。
小鼠应健康无病。
使用无血清培养基培养脂肪干细胞。
根据需要调整胶原酶消化时间和离心速度。
